167238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új hipokalcémiás hatású peptidek előállítására
167238 81 82 Op.: 137—138°; [a]D = —31° (c = 2,0, dimetilformamidban); Rf7 = 0,74 (szilikagélen). 17. H-Met-Leu-Gly-OH-trifluoracetát 6,9 g BOC-Met-Leu-Gly-OH vegyületet 70 ml 90%-os trifluoreeetsavoldattal oldunk és 1 órán át 20°-on tartjuk. Majd az oldatot beszűkítjük, keverés közben 150 ml étert adunk hozzá és egy éjszakán át —10°-on állni hagyjuk. A keletkezett csapadékot leszűrjük és ismét 100 ml éterrel keverjük, leszűrjük, kétszer éterrel mossuk és vákuumban nátriumhidroxid felett szárítjuk. Op.: 134—135°; Rf7 = = 0,52 (szilikagélen). 18. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-OH 800 mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-NHNH2 (15% káliumacetát tartalmú) vegyületet 15 ml dimetilformamidban szuszpendálunk és 15 percig 45°-on keverjük; a szuszpenzió egy része oldatba megy. Ezután 0°-ra hűtjük és először 1,45 ml tetrahidrofurános (2 n) sósavoldatot adunk hozzá, majd ismét —20°-ra hűtjük és 0,114 ml izo-amilnitritet csepegtetünk hozzá. 10 percig —20°-on tartjuk, majd 0,24 ml trietilamint, végül 431 mg H-Met-Leu-Gly-OH trifluoracetát 5 ml dimetilformamidos, előre lehűtött oldatát adjuk hozzá. Dimetilformamidos trietilaminoldatot csepegtetünk az oldathoz addig, míg az elegy pH-ja megnedvesített indikátorpapírral mérve 6 lesz. A zavaros oldatot három napig 0°-on tartjuk, majd a keletkezett csapadékot leszűrjük. A szűrletet nagy vákuumban szárazra pároljuk; a maradékot háromszor 10%-os citromsavoldattal elkeverjük, a keletkezett terméket leszűrjük és nagy vákuumban szárítjuk. Rf6 = 0,68; Rf 7 = = 0,75 (szilikagélen). 9. példa Pal-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Be-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2-hidroklorid (Cys 1 -palmitoil-kalcitonin M hidroklorid) I 171 mg Pal-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)I -Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)--Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-val-Gly-Ala-Pro-NH2 vegyülethez 5 ml jéghideg, analitikáikig tiszta, tömény sósavat adunk és addig keverjük, míg az egész feloldódik, (kb. 2 perc) és az oldatot ezután nitrogénatmoszférában további 8 percig 0°-on állni hagyjuk. Ezután a gázalakban oldott sósavgázt 1 percig 0,01 torr-ra való evakuálással eltávolítjuk, 100 ml terc-butanolt adunk hozzá és liofilizáljuk. így 138 mg Cys^palmitoil-kalcitonin M hidrokloridot kapunk, színtelen porként. Alumíniumoxidon (,,Alox"-on) végzett vékonyrétegkromatográfiás eljárás során Rf45 = 0,52, Rf52 = 0,76. A termék a Kumar szerint végzett vizsgálatban kalcitonin M-el szemben jelentősen hosszabb hatást mutat. A kiindulási anyagként alkalmazott, védett palmitoil-dotriakontapeptidet a következőképpen állíthatjuk elő: 8 1. Palmitinsav-p-nitrofenilészter (Pal-ONP, = hexadekánsav-p-nitrofenilészter) 5,0 g p-nitrofenol 60 ml kloroform-éter elegyes (1:1) oldatához jéghűtés közben először 9,4 mg palmitilkloridot, majd 5,0 ml trietilamint adunk, 2 órás, 10 visszafolyatás közben történő forralás után etilacetátban felvesszük és a szerves fázist 0,5 n káliumhidroxidoldattal és vízzel mossuk, nátriumszulfát felett szárítjuk és bepároljuk. Éter-petroléter elegyből átkristályosítva lemezek keletkeznek, op.: 15 64—65°. 2. Pal-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe 1,32 g H-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe-acetát (4. példa 2. pont) és 780 mg palmitinsav-p-nitrofenil-20 észter elegyét 20 ml frissen desztillált dimetilformamidban oldjuk és 24 óráig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az oldószer lepárlása után visszamaradt nyers terméket metanolból kicsapva a vegyületet vékonyrétegkromatográfiásan tiszta alak-25 ban kapjuk. 3. Pal-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH2 1,35 g Pal-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe 40 ml metanolos oldatához 4,0 ml hidrazinhidrátot adunk 30 és az oldatot 24 óráig szobahőmérsékleten tartjuk. Ezután forgó bepárlón 25°-on kb. 20 ml-re pároljuk be és 150 ml 0,5 n ecetsavat adunk hozzá. A kivált terméket leszűrjük, hideg vízzel mossuk és nátriumhidroxid felett szárítjuk. Szilikagélen végzett vé-35 konyrétegkromatográfiás vizsgálat során Rf100 = = 0,45. 4. Pal-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH 40 1,08 g Pal-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH2 10 ml dimetilformamidos oldatához —15°-on 1,5 ml 2,0 n etilacetátos sósavoldatot és 0,17 ml terc-butilnitritet adunk. —10°-on tartjuk 15 percig, majd 980 mg H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH 45 (2. példa 10. pont) —10°-ra hűtött, 10 ml dietilformamidos oldatát csepegtetjük. Egy órás, —10°-on, valamint 15 órán át 0°-on történő állás után 30 ml metanolt adunk hozzá és a kicsapódott terméket leszűrjük, hideg metanollal mossuk és 40°-on nagy 50 vákuumban szárítjuk. A keletkezett port háromszor 10—10 ml vízzel eldörzsöljük és nátriumhidroxid felett szárítjuk. Dimetilformamid-metanol elegyből kicsapva a termék vékonyrétegkromatográfiásan tiszta. 5. Pal-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gys-Met-Leu-Gly-OH 60 670 mg Pal-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr (tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH 50 ml dimetilformamidos oldatát szobahőmérsékleten 20 perc alatt 1,0 g jód 150 ml erősen kevert metanolos oldatához csepegtetjük. Még egy órán át keverjük, majd a 65 reakcióelegyet 0°-on 1 n nátriumtioszulfátoldatot 41
