167238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új hipokalcémiás hatású peptidek előállítására
75 167238 76 butilnitrittel hozunk össze. 15 percig —10°-on tartjuk, majd 1,38 g H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH (2. példa 10. pont) és 0,7 ml trietilamin 10 ml dimetilformamidos, —10°-ra hűtött oldatát csepegtetjük hozzá. Ezt még egy óráig —10°-on keverjük ós 15 órán át 0°-on állni hagyjuk. Ezután 20 ml metanol hozzáadása után leszűrjük, a csapadékot hideg metanollal mossuk, majd vízzel eldörzsöljük és nátriumhidroxid felett szárítjuk. A vékonyrétegkromatográfiásan egységes termék 40%-ban trietilammóniumsóként van jelen. Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatok szerint Rf = 0,55, kloroform-metanol (7:3) rendszerben. I 1 5. Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tGu)-Cys-Met--Leu-Gly-OH 1,4 g Bmp(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH 150 ml dimetilformamidos oldatához szobahőmérsékleten 0,3 ml 1 n sósavoldatot adunk. Az oldatot 30 perc alatt, 2,25 g jód erősen kevert, 500 ml metanolos oldatához csepegtetjük. Az elegyet még egy órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd 0°-ra hűtjük, és 1,0 n nátriumtioszulfátoldat hozzácsepegtetésével színtelenítjük. 1,6 ml 0,5 n nátriumhidroxidoldat hozzáadása után 40° fürdőhőmérséklet mellett kb. 20 mire pároljuk be, 400 ml étert adunk hozzá és dekantáljuk. A maradékot 20 ml vízzel eldörzsöljük, szűrjük, hideg vízzel mossuk és nátriumhidroxid felett szárítjuk. A terméket kloroform-éter elegyből kikristályosítva tisztítjuk. Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során Rf121 A = = 0,43, Rfl00 = 0,34, Rf43 = 0,28. I 1 6. Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-;yr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp (OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 I 1 46 mg Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys--Met-Leu-Gly-OH, 81 mg H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp-(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe -His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (3. példa 11. pont) vegyületeket, 9,7 mg N-hidroxiszukcinimidet és 13 mg diciklohexikarbodiimidet 2 ml dimetilformamidban 3,5 órán át 45°-on tartunk. Az átlátszó oldatot 40 ml abszolút éterbe csepegtetjük 0° hőmérsékleten és a keletkezett terméket leszűrjük. Metanol-víz elegyből kicsapva tisztítjuk. Rf45 = 0,38, szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatban. 6. példa H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro (Ac)-NHa (Pro 32 -acetil-kalcitonin M) 100 mg kalcitonin M-acetátot (vagy -hidroxikloridot) 5 ml víz-dimetilformamid (2:1) elegyben oldunk, 77jul 10%-os dimetilformamidos p-nitrofenilacetát oldatot adunk hozzá és az oldat pH-ját 0,5 mólos vizes trietilaminoldattal 9, l-re állítjuk. A reakciót ezen a pH-értéken hajtjuk végre, és a pH-értékeket trietilamin állandó hozzáadásával konstans értéken tartva kb. 1 óra múlva befejezzük a 5 reakciót. Ezután 150/íl jégecetet adunk hozzá és háromszor 10 ml etilacetáttal extraháljuk. A vizes fázist szárazra pároljuk és a maradékot Craig-megoszlatássaln-butanol-jégecet-víz (4:1:5) rendszerben 170 lépcsőben tisztítjuk. A 109—138 részletekből 10 { r maz = 122; K = 2,5) szárazra párlással kapjuk a tiszta Pro32 -acetil-kalcitonin M-et, amorf, vízoldható porként. „Selecta" cellulózon végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat szerint Rf101 A = 0,67; alumínium-15 oxidon („Alox", Camag) Rf52 = 0,68. Cellulóz-vékonyréteges lemezeken („Selecta") végzett elektroforézis során 17 V/cm feszültségnél, 1,5 órán át, pH 1,9 értéknél, 2,6 cm-t mozdul a katód felé, pH 8,0-nál 0,6 cm-t az anód felé. 20 , • 7. példa Cysx -acetil-, Pro 32 -acetil-, illetve Cys1 , Pro32 -diacetil-kalcitonin M 10 mg kalcitonin M-acetátot 2 ml abszolút dime-25 tilformamidban oldunk, 0,5 ml 1%-os dimetilformamidos p-nitrofenilacetát oldatot adunk hozzá, nitrogénnel átöblítjük, és a zárt lombikot 30 percig 40°-on állni hagyjuk. Ezután 5 ml 12 n ecetsavoldatot adunk hozzá, kiextraháljuk a p-nitrofenilacetát 30 felesleget, és a keletkezett p-nitrofenolt etilacetáttal (2X30 ml), a vizes fázist vákuumban bepároljuk, 0,5 ml 95%-os ecetsavban újraoldjuk és liofilizáljuk. A termék a mono- és diacetilszármazék keveréke, kevés kiindulási anyag mellett. A monoacetilszár-35 mazék ismét csak a Cys1 - és Pro32 -acetilszármazék keveréke, ami pH 8 értéken történő elektroforézisen látható. A kiindulási anyag, mono- és diacetilvegyülel elválasztása Craig-megoszlatással történik, n-butanol 40 jégecet-víz (4-1:5) rendszerben, vagy cellulózréteg lemezeken („Selecta") végzett vékonyrétegelektroforózissel, pH 1,9 értéken (1,5 óra, 17 V/cm feszültség); a futási sávokat lásd alább. Az ilyen módon kapott kétmonoacetilszármazékelegyetismétprepa-45 paratív vékonyrétegleketroforézissel választjuk el, pH 8 értéken (puffer: 0,1 mólos trietilaminoldat, széndioxiddal pH 8-ra állítva; 3 óra, 17 V/cm). Nagyobb anyagmennyiségek esetén a folyamatos, hordozómentes elektroforézist alkalmazzuk, ugyan-50 csak pH 8 értéken. Mindkét esetben a Cysx-acetilszármazék elektromosan semleges, míg a Pro32-acetilszármazék az anód felé fut. A vegyületek a következő Rf -értékeket mutatják: Cys1 -acetil-kalcitoninM „Selecta" cellulózon: Rf 101 A 55 = 0,67, alumíniumoxidon („Alox", Camag): Rf52 = = 0,68. A Pro32 -acetil-kalcitoninnak mindkét rendszerben ugyanaz az Rf-értéke volt, mint a Cys^acetil-kalcitonon M-nek (a kalcitonin M ezekben a rendszerek-60 ben R10lA = 0,56 és Rf52 = 0,62 értékeket adott). A Cys1 -Pro 32 -diacetil-kalcitonin M ebben a kétrendszerben Rf0lA = 0,75 és Rf52 = 0,73 értékekkel rendelkezik. Cellulóz („Selecta)" vékonyréteges lemezeken végzett elektroforézis során a Cys1 - és 65 Pro31 -monoacetil-kalcitonin M futtatási sávja: 38
