167238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új hipokalcémiás hatású peptidek előállítására

167238 73 74 oxid felett szárítjuk. Tisztítás célj ából forró metanolból kicsapjuk. Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során Rf53

= 0,55. 5. Ac-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH 1,44 g Ac-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH2

vegyületet 10 ml dimetilformamidban oldunk és nitrogénbevezetés mellett, —10°-on, 2,5 ml 2,0 n etilacetátos sósavoldatot és 0,26 ml terc-butilnitritet adunk hozzá. 15 percig —10°-on tartjuk, majd l,02g H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH-acetát (2. példa 10. pont) és 0,84 ml trietilamin 12 ml dimetilformamidos, —10°-ra hűtött oldatát csepegtetjük hozzá úgy, hogy a hőmérséklet —10° fölé ne emelkedjen. Még egy órán át —10°-on keverjük és 24 órán át 0°-on állni hagyjuk. A termék gélként kiválik. A reakcióelegyet kb. 5 ml-re bepároljuk, 20 ml metanolt hozzáadva teljesen kicsapjuk, leszűrjük és hideg dimetilformamid-metanol (1:1) eleggyel mossuk. Vízzel háromszor eldörzsöljük és nátriumhidroxid felett szárítjuk, majd egyszer dimetilformamid-metanol elegyből kicsapjuk, amikor a nehezen oldódó terméket tiszta alakban kapjuk. Rf = 0,25 szilikagélen, kloroform-metanol (8:2) rendszerben. 6. Ac-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys--Met-Leu-Gly-OH 410 mg Ac-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH 35 ml dimetil formamidos oldatát szobahőmérsékleten 15 perc, alatt 1,0 g jód 150 ml metanolos, erősen kevert oldatához csepegtetjük. A hozzáadás befejezése után még egy óráig keverjük, majd 0°-ra hűtjük és a reakcióelegyet 1,0 n nátriumtioszulfátoldatot hozzácsepegtetve elszíntelenítjük. Vízsugárszivattyúval előállított vákuumban először a metanolt lepároljuk, majd nagy vákuumban kb. 10 ml-re pároljuk be és 200 ml étert adunk hozzá. Az oldószert dekantáljuk a kivált gyantáról, háromszor éterrel és háromszor vízzel eldörzsöljük és nagy vákuumban nátriumhidroxid felett szárítjuk. Tisztítás céljából kloroformban oldjuk, szűrjük és a terméket a szűrletből hexánnal kicsapjuk Rf?0

= 0,50,

Rf43(7

= = 0,35, szilikagéles lemezen. 7. Ac-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr (tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHa _L16 mg Ac-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)I -Cys-Met-Leu-Gly-OH, 250 mg H-Thr(tBu)-Tyr (tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (3.

példa 11. pont) és 16 mg N-hidroxiszukcinimid elegyét 2 ml dimetilformamidban oldjuk, ehhez szobahőmérsékleten 30 mg száraz diciklohexilkarbodiimidet adunk és nitrogénbevezetés közben 24 órán át 40°-on állni hagyjuk. Ezután anélkül, hogy a diciklohexilkarbamidot leszűrnénk, nagy vákuumban olajjá pároljuk be és ezt metanol-éter (1:1) eleggyel porrá dörzsöljük és leszűrjük. A terméket metanol-éter elegyből kétszer kicsapva tisztítjuk. Rf43

E

= 0,50, Rf52

A

= 0,30, Rf100

= 0,32, Pf

107

= 0,65,

szilikagéles lemezeken. 5. példa Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-10 -Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (Cys1

-dezamino-kalcitonin

M) 50 mg Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-15 -Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr (tBu)-Phe-Pro-Tln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Glfi-Val-Gyl-Ala-Pro-NH2 vegyülethez nitrogónatmoszférában 0°-on 0,95 ml tömény sósavat adunk. Még 5 percig reagáltatjuk, majd a reakcióedényre keverés közben 20 nagy vákuumot kapcsolunk, 5 perc múlva 40 ml terc-butanolt adunk hozzá és liofilizáljuk. Nagy mennyiségű fehér por keletkezik. Cellulózon végzett vékonyrétegkromatográfiás eljárás során Rf45

= = 0,54, Rf52

=

0,34, alumíniumoxidon Rf45

= 0,47, 25 Rf42

= 0,61 és

Rf79

= 0,66. A termék „Selecta" 1440 cellulózon végzett elektroforézis során (pH 1,9, 1,5 óra, 280 V) 1,8 cm-t fut, pH 4,8-nél: 1,2 cm-t fut a katód felé. A kiindulási anyagot a következőképpen állít-30 hatjuk

elő: 1. Bmp(TRI)-OH 6,37 g frissen desztillált (3-merkaptopropionsavat 100 ml benzolban oldunk és 0°-on nitrogénbevezetós közben 25,1 g trifenilklórmetánt adunk hozzá rész-35 létenként. A hozzáadás befejezte után a jéghűtést eltávolítjuk. Az először tiszta oldatból a termék elkezd kiválni. 2 óra múlva 0°-ra hűtjük, szűrjük és hideg metanollal mossuk. Metilénklorid-metanol elegyből átkristályosítva a keletkezett tiszta termék 40 200—201°-on olvad. 2. Bmp(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe 2,62 g Bmp(TRI)-OH és 1,58 g H-Gly-Asn-Leu-OMe (1. példa 4. pont) 30 ml dimetilformamidos 45 oldatához 1,85 g diciklohexilkarbodiimidet adunk. 24 órás 0°-on történő állás után a diciklohexilkarbamidot leszűrjük és a szűrletet 40°-on szárazra pároljuk. A terméket metanolból kicsapva tisztítjuk. Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás 50 vizsgálat során

Rf45

= 0,67. 3. Bmp(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH2 1,06 g Bmp(TRI)-Gly-Asn-Le-OMe vegyületet 30 ml metanolos oldatban 3 ml hidrazinhidráttal 55 elegyítünk..

2 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, ezalatt a hidrazid beoltás hatására kikristályosodik. Op.: 190—194°. Rf

=

0,35, kloroform-metanol (8:2) rendszerben. 60 4.

Bmp(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser-(tBu)-Thr(tBu)--Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH és tietilammóniumsója 926 mg Bmp(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH2

vegyületet 8 ml dimetilformamidban —15°-on 2,21 ml 65 2,21 n

etilacetátos sósavoldattal és 0,18 ml terc-37