167238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új hipokalcémiás hatású peptidek előállítására
167238 58 57 mon az Rf-érték toluol-aceton (7:3) rendszerben 0,42. 8a. DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-NH-NH2 5,7 g DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-NH-NH2 50 ml dimetilformamidos oldatához —15°-on 16,35 ml 1,53 n etilacetátos sósavoldatot és 1,4 ml terc-butilnitritet adunk és az elegyet 15 percig —10°-on állni hagyjuk. 3,5 ml trietilamin hozzáadása után 3,63 g H-Cys(TRI)-OH és 1,4 ml trietilamin 40 ml dimetilformamidos, —10°-ra lehűtött oldatát csepegtetjük, 1 órán át —10°-on keverjük, majd 15 óráig 0°-on tartjuk. A tiszta oldatot 40°-on nagy vákuumban bepároljuk, a maradékot etilacetátban és vízben felvesszük, és a szerves fázist 50%-ig telített nátriumkloridoldattal mossuk. Az oldószer lepárlása után keletkezett olajat kevés etilacetátban oldjuk és 300 ml (0°-on kevert) petroléterbe öntjük. A termék kissé sárgás porként válik ki. Szilikagéles vékonyrétegkromatogramon kloroform-metanol (7:3) rendszerben az Rf-érték 0,62. 8b. H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-OH 909 mg DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-OH vegyületet 10 ml metilénkloridban oldunk, 12 ml monoklórecetsav-víz elegyet (75 g klórecetsav-25 ml víz) adunk hozzá és szobahőmérsékleten 15 percig keverjük. Az oldatot ezután 0°-ra hűtjük, 50 ml vizet adunk hozzá és tömény ammóniaoldattal pH 6,5-re állítjuk. Ekkor a termék olajként kiválik. Ezt még kétszer vízzel eldörzsöljük, majd terc-butanolban felvesszük és liofilizáljuk. A liofílizátumot petroléterrel eldörzsölve egységes termék keletkezik. Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat alapján az Rf-érték kloroform-metanol (1:1) rendszerben 0,40; Rf-érték metanolban = = 0,50. 9. H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMe 2 g DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMe vegyületet 45°-on 40 ml 80%-os ecetsavoldatban oldunk, majd egy órán át 45°-on állni hagyjuk. Ezután vákuumban kb. 10 ml-re pároljuk be és liofilizáljuk. A maradékot az ecetsav teljes eltávolítására 15 ml terc-butanolban és 1,5 ml vízben oldjuk és mégegyszer liofilizáljuk. így egy poralakú terméket kapunk, melyet 5 ml metanolban és 20 ml etilacetátban oldunk és 150 ml petrolétert hozzáadva ismét kicsapunk. Rövid 0°-on állás után leszűrjük, petroléterrel mossuk és szárítjuk. így amorf 180°-on olvadó port kapunk, amely szennyezésként csak 2-(p-bifenilil)-propanol(2) nyomokat tartalmaz. A hexapeptidet ebben a formában felhasználhatjuk a további feldolgozás során. Szilikagélen készített vékonyrétegkromatogramon a következő Rf -értékeket mutatja: kloroform-aceton (1:1) rendszerben: 0,48, kloroform-metanol (9:1) rendszerben: 0,54, toluol-aceton (1:1) rendszerben: 0,49. 10. H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH 1,4 g, 9. pont szerinti hexapeptid-metilésztert 45°-on 16 ml 90%-os metanolban oldunk, 20°-ra hűtjük (miközben a peptid részben ismét kicsapódik) és 4,32 ml 1 n nátriumhidroxidoldatot adunk hozzá. A szuszpenziót 25 percig 22°-on keverjük 5 (kb. 15 perc múlva az egész tisztán oldódik) és a hexapeptidet 4,32 ml 1 n sósavoldat és 30 ml víz hozzáadásával finom pelyhes csapadékként kicsapjuk. Ezután 15 percig 0°-on állni hagyjuk, szűrjük, vízzel addig mossuk, míg a szűrlet kloridmentes lesz. 10 Káliumhidroxid és foszforpentoxid felett szárítva 1,3 g nyerstermék keletkezik, melyet tisztítás céljából 5 percig 80°-on 25 ml dimetilformamid és 60 ml benzol elegyével homogenizálunk és 120 ml petrolétert hozzáadva kicsapunk. 10 perces, 0°-on történő 15 állás után az anyagot leszűrjük, benzollal és petroléterrel mossuk és szárítjuk. Az így keletkezett, kromatográfia szerint tiszta hexapeptidszármazék bomláspontja kb. 210° és sok oldószerben igen nehezen oldódik. Szilikagélen végzett vókonyrétegkromatog-20 ráfiában Rf45 = 0,39, Rf52 = 0,77, Rfxoo = 0,47. 25 11. BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu) -Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH 1,04 g BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH2 vegyületet 8 ml abszolút dimetilformamidban oldunk, —25°-ra hűtjük és lassan 0,92 ml 3,6 n dioxános só-30 savoldatot csepegtetünk hozzá, majd 0,179 ml tercbutilnitritet. Az elegyet 15 percig —10°-on keverjük, majd —15°-ra hűtjük, és 878 mg H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH és 0,5588 ml trietilamin 12 ml abszolút dimetilformamidos, 35 —15°-ra hűtött oldatához pipettázzuk. Az elegyet kb. 10 percig —10°-on keverjük, majd három órán át 0°-on. A gyengén bázikus (pH kb. 8) reakció fenntartására kezdetben még kétszer 0,065 ml trietilamint adunk hozzá. Az elegyet 15 percig 0°-on 40 tartjuk, majd nagy vákuumban pépes sűrűségűre pároljuk be. 50 ml etanolt hozzáadva a dekapeptidszármazék kicsapódik. A szuszpenziót 5 percig 40°ra melegítjük, 10 percig 0°-on állni hagyjuk, leszűrjük és a csapadékot 20 ml metanollal mossuk. 45 Nagy vákuumban káliumhidroxid és foszforpentoxid felett szárítva tiszta dekapeptidet kapunk, melynek bomláspontja nem jól definiált: kb. 220— —230°-on van. Szilikagélen készített vókonyrétegkromatogram a következő Rf-értékeket adja: 50 kloroform-metanol (8:2) rendszerben: 0,28 70 rendszerben: 0,55, 104 rendszerben: 0,75, 121 A rendszerben: 0,59. 55 12. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-OH 1,7 g BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH vegyületet 170 ml forró dimetilformamidban oldunk és szoba-60 hőmérsékletre hűtés után 1 óra alatt 2,5 jód intenzíven kevert 500 ml metanolos oldatához csepegtetjük. Ezután még egy óráig keverjük és a 0°-ra lehűtött oldatot 1 n nátriumtioszulfátoldattal csaknem teljesen elszíntelenítjük. Az oldatot először 65 vákuumban, végül nagy vákuumban 40°-on bepá-29
