167238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új hipokalcémiás hatású peptidek előállítására
167238 55 56 nagy vákuumban ragacsos massza képződóséig pároljuk be, 200 ml n-butanolban oldjuk és egymás után vízzel, 5%-os borkősavoldattal, 1 n nátriumhidrogénkarbonátoldattal és ismét vízzel mossuk. Az oldatot ezután kb. 50 ml-re pároljuk be, és ebből a tetrapeptidszármazékot 300 ml petroléter hozzáadásával kicsapjuk. Az anyagot dimetilformamid-víz és metanol-etilacetát-petroléter elegyből kicsapva tisztítjuk, és így a tetrapeptidszármazékot amorf, 145—148° olvadáspontú porként kapjuk. Szilikagéles vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat a következő Rf-értékeket adja: Rf115 = 0,68; Rf (aceton) = 0,59; Rf (kloroform-metanol 8:2) = = 0,60. 3. BOC-Cys(TRI)-Gly-Axn-Leu-NH-NH2 2,7 g BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe vegyületet 22 ml metanolban oldunk, 0°-ra hűtjük és 2,2 ml hidrazinhidrátot adunk hozzá. Kb. 30 percig 4°-on tartjuk, majd az oldatot egy éjszakán át kb. 20°-on állni hagyjuk, majd ismét 0°-ra hűtjük és 102 ml jéghideg 3%-os ecetsavoldatot adunk hozzá. A csapadékot jól homogenizáljuk, leszűrjük és a nuccson jéghideg, 3%-os ecetsavoldattal negatív Folinreakcióig mossuk, majd szárítjuk. így 2,2 g, kromatográfiásan tiszta tetrapeptid-hidrazid keletkezik, melynek bomlási pontja kb. 195°. Az anyag szilikagéles vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során a következő Rf-értékeket mutatja: Rf (koloroform-métanol 8:2)<= 0,30, Rf (aceton-metanol 9:1) = = 0,53. 4. BOC-Met-Leu-Gly-OMe 6,72 g Z-Leu-Gly-OMe vegyületet 50 ml metanolban 500 mg (10%-os) palládium-szén-katalizátor jelenlétében a hidrogénfelvétel megszűnéséig hidrogénezünk. Az oldatot leszűrjük a katalizátorról és vákuumban kb. 10 ml-re pároljuk be, 30 ml dimetilformamiddal hígítjuk és nagy vákuumban ismét kb. 20 ml-re koncentráljuk be. Jéghűtés közben 7,7 g BOC-Met-OCP vegyületet adunk hozzá, a tiszta oldatot 6 órán át 20°-on állni hagyjuk, majd az oldószert nagy vákuumban lepároljuk. Az olajos maradékot etilacetátban oldjuk és egymás után 0° hőmérsékleten 5%-os káliumhidroxidoldattal, 4,2 n sósavoldattal, majd vízzel mossuk, a szerves fázis nátriumszulfát felett szárítjuk, és szárazra pároljuk. Az olajos maradékot benzol-petroléter elegyből kikristályosítjuk ; op.: 126—127°; szilikagélen az Rfértékek: Rf^c = 0,66; Rf (toluol-aceton 1:1) = = 0,58. 5. H-Met-Leu-Gly-OMe-hidroklorid 3,24 g BOC-Met-Leu-Gly-OMe vegyületet 13 ml 3,8 n etilacetátos sósavoldatban oldunk és 30 percig 20°-on állni hagyjuk. 100 ml petrolétert hozzáadva a tripeptidészter-hidrokloridot ragacsos masszaként kicsapjuk és a felülúszót dekantáljuk. 0°-on 100 ml peroxidmentes éterrel eldörzsöljük, és így finom, poralakú terméket kapunk, melyet leszűrünk és káliumhidroxid felett szobahőmérsékleten exszikkátorban súlyállandóságig szárítunk. A vegyület a kromatógráfia szerint tiszta, de amorf és erősen higroszkópos. Szilikagélen a következő Rf-értékeket adja: Rf43 o = 0,48; R f (toluol-aceton 1:1) = 0,35. 6. TRI-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMe 5 3,22 g TRI-Cys(TRI)-OH vegyületet (Bull. Soc. Chim. France 1956, 698. o.), 1,97 g H-Met-Leu-Gly-OMe-hidrokloridot és 0,74 ml trietilamint 32 ml acetonitrilben oldunk és 1,54 g szilárdcdiciklohexilkarbodiimidet adunk hozzá. A kezdetben tiszta 10 oldatot, melyből később kiválik a diciklohexiíkarbamid, 16 órán át 20°-on állni hagyjuk. Ezután 0°-ra hűtjük, 100 ml vizet adunk hozzá, homogenizáljuk és a fehér csapadékot leszűrjük. Ezt vízzel mossuk, szárítjuk, majd 5 percen át 40°-on 50 ml etilacetát-15 tal alaposan eldörzsöljük. Az oldhatatlan diciklohexilkarbamidot szobahőmérsékleten leszűrjük, és 20mletilacetáttalmossuk. A szűrletből300 mlpetroléterrel kocsonyás csapadékként kicsapjuk a tetrapeptidszármazékot, majd szűrjük és szárítjuk. Ezt 20 a nyers terméket metanol-etilacetát-petroléter elegyből kicsapva kromatográfiásan egységes terméket kapunk, op.: ~ 215°. Szilikagélen a következő Rfértékeket adja: Rf kloroform-metanol (97-3) rendszerben = 0,57; Rf n-butilacetátban = 0,51. 25 7. H-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMe-acetát 1,862 g TRI-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMe 16 ml jégecetes oldatához 4 ml vizet csepegtetünk úgy, hogy a keletkezett csapadók mindig újraoldódjon. 30 A tiszta oldatot 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd 0°-on 12 ml vizet adunk hozzá, szűrjük és a csapadókot hideg 50%-os ecetsavoldattal mossuk. A szűrletet nagy vákuumban 30°-on olajjá pároljuk be, ezt vízzel eldörzsöljük és liofilizáljuk. Az 35 így keletkezett fehér port 15 óráig káliumhidroxid felett nagy vákuumban szárítjuk. A termék szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat szerint egységes. Rf-érték tuloul-aceton (7:3) rendszerben = 0,28, kloroform-metanol (95:5) rend-40 szerben = 0,48. 8. DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMe 2,284 g DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-NH-NH2 (lásd 46 1. példa, 13. pont) 15 ml dimetilformamidos oldatához —20°-on 6,5 ml 1,53 n etilacetátos sósavoldatot és 0,51 ml terc-butilnitritet adunk és 15 percig —10°-on keverjük. 1,4 ml trietilamin hozzáadása után —10°-ra hűtött, 1,406 g H-Cys(TRI)-Met-Leu-50 -Gly-OMe acetát 10 ml dimetilformamidos oldatát csepegtetjük hozzá. A reakcióelegy pH-értéke kb. 5. 2 csepp dimetilformamidos trietilamin-oldattal (2,8 ml trietilamin 10 ml-re töltve dimetilformamiddal) a pH-t 7—8 értékre állítjuk be, 5, 10 és 15 perc 55 múlva 2—2 csepp trietilamin-oldatot csepegtetünk hozzá és a pH-t ismét 7—8-ra növeljük. Egy idő múlva ez az érték állandó marad. A reakcióelegyet egy órán át —10°-on, 15 órán át pedig 0°-on tartjuk, majd a kivált trietilamin-hidrokloridot leszűrjük és 60 a szűrletet nagy vákuumban 30°-on olajjá pároljuk be. Vízzel eldörzsölve por keletkezik, melyet vízzel mosunk és vízzel eldörzsölünk, majd liofilizálunk. Kétszer 10 ml benzol-petroléter (1:2) eleggyel eldörzsölve a hexapeptidszármazékot tiszta állapot-65 ban kapjuk. Szilikagéles vékonyrétegkromatogra-28
