167238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új hipokalcémiás hatású peptidek előállítására
41 5. BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe 710 mg H-Gly4Asn-Leu-OMe és 1,36 g BOC-Cys (TRI)-OH vegyületeket 12 ml acetonitrilben oldunk és a 0°-ra hűtött oldathoz 820 mg diciklohexilkarbodiimidet adunk. 30 percig 0°-on, majd 60 órán át 28°-on tartjuk, majd a diciklohexilkarbamidot leszívatjuk és a szűrletet szárazra pároljuk. A maradékhoz petrolétert adunk, eldörzsöljük, a petroléteres oldatot dekantáljuk, és a nem oldódott terméket etilacetátban felvesszük. Az etilacetátos oldatot 0°-on híg citromsavoldattal, vízzel, nátriumhidrogénkarbonátoldattal és vízzel mossuk, nátriumszulfáttal szárítjuk és bepároljuk. A színtelen gyantaként keletkezett tetrapeptidszármazékot tisztítás céljából aceton-éter elegyből többször kicsapjuk. Termelés: 1,2 g por, amely a vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatok (szilikagélen végezve) szerint egységes. R/- = 0,39, kloroform-metanol (9-1) rendszerben. 6. BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH2 988 mg BOC-Cys(TRI)-Gly-Ash-Leu-OMe vegyületet 20 ml metanolban oldunk és a 0°-ra hűtött oldathoz 2 ml hidrazinhidrátot adunk. 14 órás, 2°-on történt állás után 200 ml jéghideg 0,5 n ecetsavat adunk hozzá, a keletkezett csapadékot alaposan eldörzsöljük, leszívatjuk, jeges vízzel semlegesre mossuk, és vákuumexszikkátorban egy éjszakán át szárítjuk. A nyers BOC-Cys(TRI) Gly-Asn-Leu-NH-NH2 vegyületet metanol-víz elegyből kétszer kicsapva tisztítjuk. Szilikagéles lemezeken végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során az Rférték kloroform-metanol (9:1) rendszerben 0,2. 7. BOC-Met-Leu-Gly-OMe 5 g Z-Leu-Gly-OMe [J. Am. Chem. Soc. 78, 2126 (1956)] vegyületet 200 ml metanolban oldunk, ós a 0°-ra hűtött oldatot 1 g palládium-szén katalizátor (10% Pd) jelenlétében hidrogénezzük. A hidrogénezésbefejeztévela katalizátort leszívatjukés a szűrletet 25° fürdőhőmérséklet mellett vákuumban bepároljuk. Az olajos maradékot minden további tisztítás nélkül 4 g BOC-Het-OH vegyülettel egyesítjük és az elegyet 100 ml acetonitrilben oldjuk. Ezután vákuumban 60 ml-re pároljuk be, 0°-ra hűtjük, és 4,5 g diciklohexilkarbodiimidet adunk hozzá. Nitrogénbevezetés után 30 percig 0°-on, 18 órán át 25°-on tartjuk. Ezután a kivált diciklohexilkarbamidot leszívatjuk, és a szűrletet szárazra pároljuk. A maradékot petroléterben eldörzsölve mossuk, a petroléteres oldatot dekantáljuk, és az oldhatatlan terméket szárítjuk. Ezután etilacetátban oldjuk, és az oldatot híg citromsavoldattal, vízzel, nátriumhidrogénkarbonátoldattal és vízzel mossuk, nátriumszulfáttal szárítjuk és bepároljuk. A maradékot tisztítás céljából minimális mennyiségű peroxidmentes acetonban oldjuk és peroxidmentes étert hozzáadva kicsapjuk; így a BOC-Met-Leu-Gly-OMe tripeptidszármazékot szilárd porként kapjuk. 8. H-Met-Leu-Gly-OMe-hidroklorid 3 g 7. példa szerint előállított tripeptidszármazékot 60 ml 0,4 n etilacetátos sósavoldattal elegyítünk és a reakcióelegyet 90 percig 25°-on tartjuk. Ezután szárazra pároljuk, és a maradékot (H-Met-Leu-Gly-42 OMe-hidrokloridot) 24 órán át 0,01 torr nyomáson szilárd nátriumhidroxid felett szárítjuk. 9. TRI-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMe 5 1,23 g H-Met-Leu-Gly-OMe-hidroklorid és 1,43 g TRI-Cys(TRI)-OH (Amiard, Bull. Soc. Chim. France, 1956, 698. o.) vegyületeket 15 ml acetonitrillel és 300 mg N-metilmorfolinnal elegyítünk. 0°-ra való lehűtés után 800 mg diciklohexilkarbodi-10 imidet adunk hozzá és a reakcióelegyet 1 óráig 0°-on és 45 percig 30°-on nitrogénatmoszférában keverjük. Ezután leszűrjük, a szűrletet vákuumban szárazra pároljuk, és a maradékot petroléterrel eldörzsöljük. A petroléteres oldatot dekantáljuk, a mara-15 dékot szárítjuk és etilacetátban oldjuk. Az etilacetátos oldatot 0°-on citromsavoldattal, vízzel, nátriumhidrogénkarbonátoldattal és vízzel mossuk, nátriumszulfát felett szárítjuk és bepároljuk. Tisztítás céljából a nyers terméket (enyhén sárgás gyan-20 ta) lehetőleg kevés metanolban oldjuk, és az oldatot egy metanollal készített Sephadex LH—20 oszlopon (2,5+90 cm) kromatografáljuk. 4 ml-es frakciókat szedünk, egyenként bepároljuk és tisztaságukat szilikagélen végzett vókonyrótegkromatográfiás el-25 járással vizsgáljuk, kloroform-metanol (99:1) rendszerben. 10a.H-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMe-acetát 11,1 g, 9. példa szerint előállított tetrapeptidszár-30 mazékot 15 ml 75%-os ecetsavban oldunk, és 1 órán át 30°-on tartjuk. Ezután nagy vákuumban szárazra pároljuk és a maradókot peroxidmentes éterrel eldörzsöljük. Az így keletkezett szilárd port (a H-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMe acetátját) leszívatjuk, 35 éterrel mossuk, és szárítjuk. Termelés: 695 mg. 10b. H-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH-hidroklorid 740 mg H-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMe-acetátot 10 ml metanolban és 1,3 ml vízben melegemoldunk. 40 Nitrogénáramoltatás közben szobahőmérsékleten 3,0 ml 1,0 n nátriumhidroxidoldatot csepegtetünk hozzá és 25 percig keverjük. Ezután 0°-ra hűtjük, 3,0 ml 1,0 n sósavat adunk hozzá, és a pelyhes csapadékot leszűrjük, hideg vízzel mossuk és szoba-45 hőmérsékleten nátriumhidroxid felett szárítjuk nagy nyomáson, súlyállandóságig. Rf70 = 0,40; RfmA = 0,45. 11. H-Thr(tBu)-OMe 50 12,92 g (40 mmól) Z-Thr(tBu)-OMe vegyületet 200 ml jégecetben, 3 g 10%-os palládium-szénkatalizátor jelenlétében szobahőmérsékleten hidrogénezzük. A hidrogónfelvétel egy óra múlva befejeződik. Az oldatból leszűrjük a katalizátort, és víz-55 sugárszivattyúval előállított vákuumban 35°-on bepároljuk. Nagy vákuumban 35°-on történő szárítás után 7,3 g olaj keletkezik, amely a vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat szerint egységes és közvetlenül felhasználható a további lépéshez. 60 12. DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-OMe 19,3 g (38,6 mmól) DPC-Ser(tBu)-OH-ciklohexila-minsót 500 ml kloroformban felveszünk és 0°-on háromszor 25 ml 1 n citromsavoldattal és ötször 65 40 ml félig telített nátriumkloridoldattal kirázzuk. 21
