167224. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bízben oldhatatlan penicillin-aciláz enzimkészítmény előállítására
7 167224 Példa H2 N-(CH 2 ) n —NH 2 képletű diamin Acíláz mennyisége A készítmény aktivitása fj, M/min/g Elvégzett dezacilezés Példa n mennyiség Acíláz mennyisége A készítmény aktivitása fj, M/min/g készítmény mennyisége dezacilezés száma átalakítás hozama %-ban átlag 1 2 3 4 5 6 7 6 3 2 4 5 8 10 15 g 11 ml 10,2 ml 14 g 13 g 18,7 g 22,2 g ög 5g 100 ml 100 ml 150 ml 100 ml 100 ml 16 24 17,2 40 10 12,8 15,2 200 g 100 g 100 g 15 25 10 90 90 85 8. példa Az 1. példát megismételjük oly módon, hogy 300 ml puffer-oldatot, 50 ml penicillin-aciláz-enzimet 250 ml vízzel keverünk, majd 18 óra hosszat a gyantán adszorbeáltatjuk. Ezt követően az elegyhez 200 ml 25%-os vizes glutáraldehid-oldatot adunk. Az ily módon kapott készítmény aktivitása 20,6 (pi M/min/g. Abban az esetben, ha a fentiek szerinti előállított készítményből 103 g-ot használunk az 1. példában leírt benzilpenicillin dezacilezésére, a penicillin 91%-os hozammal alakítható át 6-aminopenicillánsavvá. A műveletet 5 óra hosszat végezzük. Az enzimkészítmény 18-szor használható fel. 9—10. példa A táblázatban feltüntetett mennyiségű 1,3-di aminopropánt 1500 ml 7 pH-jú 0,25 mól foszfátpuffer-oldatban oldjuk. Az oldat pH-ját 7,0-ra állítjuk, majd 25 ml penicillin-aciláz oldatot és 100 100 g Amberlit XAD—7 gyantát adunk hozzá. Az elegyet mérsékelt keverés közben 18 óra hosszat állni hagyjuk, ezt követően 200 ml 25%-os glutáraldehidet adunk hozzá és a pH-t 7,0 értékre állítjuk. Ezt követően a keverést további 18 óra hoszszat végezzük. Az anyagot ezt követően leszűrjük, és mossuk az 1. példa szerint. A kapott készítmény aktivitása a táblázatban van feltüntetve. Az előállított készítményt 1 liter 6%-os káliumbenzilpenicillin oldat dezacilezésére használhatjuk fel. A dezacilezést 7,8 pH értéken, 37 °C-on 5 óra hoszszat végezzük. A kísérletet 10-szer megismételjük. Diamin A készít- Dezacilezés mennyi- meny akti- készítmény átalakulás ' sege vitása mennyisége hozama ml-ben ,uM(min)g (g) %-ban 2 5 17,4 17,2 110 106 75 90 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11. példa 60 ml penicillin-aciláz-oldatot adunk 300 ml 7 pH-jú 0,5 mól foszfátpuffer oldathoz. Az oldathoz ezt követően 240 ml desztillált vizet és 100 g Amberlit XAD—7 gyantát adunk. Mérsékelt keverés 65 közben 18 óra alatt az enzimet a gyantán abszorbeáltatjuk. Ezt követően 11 ml 1,3-diaminopropánt és 200 ml 25%-os vizes glutáraldehid oldatot adunk az elegyhez, miközben a pH értékét 8-on tartjuk. Az elegyet végül 7,0 pH értékre állítjuk, majd 18 óra hosszat keverjük. A szilárd anyagot elkülönítjük és az 1. példában leírtak szerint mossuk. 107 g oldhatatlan enzimet kapunk, amelynek aktivitását káliumbenzilpenicillin-oldattal határozzuk meg. Az aktivitás értéke 11,92 [jiM/min/g. 12. példa 500 ml penicillin-aciláz-oldathoz, amelyet 7 pH-jú 0,2 M foszfátpufferral készítünk, 100g Amberlit XAD—7 gyantát adunk. Az elegyet 16 óra hosszat keverjük. A szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük, majd 500 ml 0,1 mólos 7 pH-jú foszfát puffer-oldattal készült 5%-os glutáraldehid-oldathoz adjuk és 16 óra hosszat keverjük. A szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük, majd 0,2%-os 0,1 mólos 7 pH-jú foszfát pufferral készült 1,3-diaminopropán-oldathoz adjuk, és 16 óra hosszat keverjük. A szilárd anyagot elkülönítjük, majd 5%-os vizes nátriumklorid-oldattal, 2,5%-os nátriummetabiszulfit-oldattal, és végül 7,0 pH-jú 0,2 mól foszfátpuffer-oldattal mossuk. A készítmény aktivitása 30,8 [xM/min/g. 13. példa 600 ml desztillált vízhez 100 g Amberlit XAD—7 gyantát adunk, amelyhez 200 ml 25%-os vizes glutáraldehid-oldatot adunk. Az oldat pH-ját 7,0 értékre állítjuk, majd a rendszert 2 óra hosszat keverjük. Az elegyhez 2 ml 1,3-diaminopropánt adunk majd mérsékelt keverés közben 18 óra hosszat állni hagyjuk. A szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük, vízzel mossuk, és 575 ml 7 pH-jú 0,2 mólos foszfátpuffer-oldatban újra szuszpendáljuk. Az elegyhez 25 ml penicillin-aciláz-oldatot adunk, majd mérsékelt keverés közben 18 óra hosszat állni hagyjuk. A szilárd anyagot 1 mólos nátriumklorid oldattal és 7,8 pH-jú 0,2 mol foszfátpuffer-oldattal mossuk. A készítmény aktivitása 42 [xM/min/g. A fenti készítmény 120 g-ját 1 liter 8%-os káliumbenzilpenicillin-oldat dezacilezéséhez használjuk fel. A műveletet 37 °C-on, 7,8, pH értéken végezzük. A 6 megismételt kísérlet eredményeként 80%-os átalakulást lehetett elérni. 4
