167224. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bízben oldhatatlan penicillin-aciláz enzimkészítmény előállítására
/ 167224 10 14. példa 500 ml 5 térfogat %-os vizes glutáraldehid-oldathoz 100 g Amberlit XAD—7 gyantát adunk, majd 7 pH-n 2 óra hosszat mérsékelten keverjük. Az elegy hez 1 ml diaminopropánt adunk. A pH értékét sósavval 7-ra állítjuk, majd a keverést 14 óra hosszat folytatjuk. A gyantát leszűrjük, vízzel mossuk, majd ismét leszűrjük, és 7 pH-jú 0,2 mól foszfátpuffer-oldattal készült penicillin-aciláz oldathoz adjuk. Ezt követően az elegyet 16 óra hosszat keverjük. Az enzimet tartalmazó gyantát szűréssel elkülönítjük, 1 ml diaminopropánt tartalmazó 7 pH-jú 500 ml vízhez adjuk, majd további 8 óra hosszat mérsékelten keverjük. A szilárd anyagot szűréssel, elkülönítjük, majd 1 mól nátrium-klorid-oldattal, 2,5 súly/térfogat %-os vizes nátriummetabiszulfit-oldattal, ezt követően 7 pH-jú 0,2 mol foszfátpuffer-oldattal kétszer mossuk. A készítmény aktivitása 35 piM/min/g. A fenti készítményből 100 g-ot liter 7 %-os káliumbenzilpenicillin dezacetilezéséhez használunk fel. A műveletet 37 °C-on, 7,8 pH értéken 5 óra hosszat végezzük. A kísérletet 25-ször megismételve azt találtuk, hogy az átalakulás 90%-nál nagyobb volt. 15. példa 1. ml diaminopropánt és 4 ml 25%-os, 0,2 mólos foszfátpuffer-oldattal készült glutáraldehid-oldatot enzim-oldattal (77 p.M/min/g gyanta) és 20 g térhálós polimetakriláttal (Amberlit XAD—7) hozunk össze, a táblázatban megadott pH értéken. A végső térfogatot 100 ml-re egészítjük ki. Az elegyet szobahőmérsékleten 16 óra hosszat keverjük, a gyantát leszűrjük és 7,8 pH-jú foszfátpufferral alaposan átmossuk. Közvetlenül ezután meghatározzuk a gyanta specifikus aktivitását. A meghatározást 37 °C-on 1, 4 és 5 napig nedvesen tárolt gyantán megismételjük. Az eredményeket a táblázat tünteti fel. tát adunk hozzá, és az elegyet 25 °C-on 16 óra hoszszat keverjük. Az elegyet leszűrjük, 6 pH-jú puffer-oldattal mossuk Az elkülönített gyantát 0,2 mól 6 pH-jú foszfát-puffer oldattal készült enzim-ol-5 dathoz adjuk. Az elegyet 25 °C-on 15 óra hosszat keverjük, majd leszűrjük és 7,8 pH-jú 0,2 mólos puffer-oldattal mossuk, és vizsgáljuk. A gyanta-enzim-készítményt nedves állapotban 37 °C-on tároljuk (7,8 pH-jú puffer-oldatban), majd a vizs-10 gálatot 1, 4 és 8 nap után megismételjük. A ,• • , . A XAD ké- Az aktivitás %-° s A diammos es csökkenése a 37 °C-aldehides elő- »zitmenyak-15 kezelés pH-ja *"?*«?» [M(mm)g ina p 4 nap 5 nap 20 25 30 35 40 5,0 7,0 9,0 37 0 7 26 1 1 12 0 14 17. példa 0,2 mólos foszfát-oldathoz 25%-os vizes glutáral dehid-oldatot és diaminopropánt adunk a táblázatban feltüntetett adatok szerint. A pH értéket 6,0-ra állítjuk, az elegy térfogatát 100 ml-re egészítjük ki. 25 g Amberlit XAD—7 gyanta hozzáadása után az elegyet 25 °C-on 16 óra hosszat keverjük. A gyantát leszűrjük, majd 6,0 pH-jú 0,2 mól puffer-oldattal mossuk. Az ily módon kapott gyantát a 6 pH-jú 0,2 mól foszfát-oldattal készült aciláz-oldathoz adjuk. Az elegyet 16 óra hosszat keverjük, szűrjük, majd 7,8 pH-jú puffer-oldattal mossuk. A gyantát vizsgáljuk, majd 37 °C-on nedves állapotban tároljuk. A vizsgálatot 8 nap után megismételjük. A diaminopro- Az enzim- Az aktivitás %-os pán és aldehid gyanta ke- csökkenése a 37 °C-kapcsolódási szítmény os tárolás során reakciójának aktivitása pH-ja j«M(min)g 1 nap 4 nap 5 nap 45 Diaminopropán térfogat százalékban Glutáralde-Aktivi, • T , ,. tás/ híd térfogat M(min) százalékban Aktivitás 8 nap után /jM(mm)g 40 34 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 38 22 40 40 41,5 19 33 33 38 12 31 31 39 11 26 26 35 7 23 23 16. példa 0,2 mólos foszfát-oldathoz 16 ml 25%-os glutáraldehid-oldatot és 1 ml diaminopropánt adunk, majd a pH-t a táblázatban megadott értékre állítjuk be. A reakcióelegy végső térfogatát 100 ml-re egészítjük ki, majd 25 g Amberlit XAD—7 gyan-50 55 60 65 10 4 41 29 4 46 29 4 41 26 18. példa 200 ml 6 pH-jú 0,2 mólos foszfát-puffer oldathoz 48 ml 25%-os vizes glutáraldehidet és 3 ml 1,3-diaminopropánt adunk. A pH-t 6,0 értékre állítjuk, a térfogatot foszfát-puffer oldattal 300 ml-re kiegészítjük. 100 g Amberlit XAD—7 gyanta hozzáadása után az elegyet 25 °C- hőmérsékleten 6 pH értéken 16 óra hosszat keverjük. A gyantát leszűrjük, majd pufferral mossuk. 6 pH-jú puffer-oldattal enzim-oldatot készítünk. Az oldat aktivitásának értékét a táblázat tünteti fel. Az oldatot 1%-os for-5
