167224. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bízben oldhatatlan penicillin-aciláz enzimkészítmény előállítására

167224 anélkül, hogy a reakció hozamában csökkenés mu-H*|f tatkozna. Azt találtuk, hogy a kapcsolási reakció pH értéke befolyásolja az enzim-készítmény stabilitását. Az enzim-gyanta stabilitását oly módon határozzuk meg, hogy a vízoldhatatlan enzim-ké- 5 szítményt 37 °C-on 7,8 pH értéknél inkubáljuk. Abban az esetben, ha a készítmény nem stabil, az enzimaktivitás csökkenése nagymértékben felgyorsul. Másik megoldásként a vízoldhatatlan enzim- 10 készítményt oly módon állítjuk elő, hogy az adszorbeáló anyagot előzetesen diamin és dialdehid elegyével kezeljük, majd ezt követően adszorbeálhatjuk az aciláz enzimet. Ennél a megoldásnál lényeges szerepet játszik a diamin és a dialdehid 15 mólaránya. A diamint és dialdehidet 1 g adszorbensre számítva 0,01—20,0, célszerűen 0,1—10,0 mmól mennyiségben alkalmazzuk. A diamin és a dialdehid mólaránya 1:0,1—1:40, célszerűen 1:1— 1:10 között van. A gyanta előzetes kezelését cél- 20 szerűen 4—9 pH értéken végezzük. Optimális körülmények között az enzimkészítmény stabilitása elegendő ahhoz, hogy legalább 50 egymást követő penicillin felhasítást végezzünk vele. Azt tapasztaltuk, hogy az enzimet a vívőanyagra 25 adszorbeáltatva az enzimaktivitás gyakran megnövekszik, különösen abban az esetben, hogy ha térhálós polimetakrilát-gyantát alkalmazunk és ha az enzimet mono- vagy dialdehiddel előkezeljük. Ebben az esetben az előkezeléshez 0,5—5,0% for- 30 maldehidet vagy 0,01—0,5% glutáraldehidet alkalmazunk 5—8 pH értéken 2—24 óra hosszat. A kezelést az enzimnek az E. coli sejtekből történő elkülönítése előtt vagy után végezzük el. Abban az esetben, ha az alkalmazott enzim tisz- 35 tasága növekszik, a kapcsolódási reakció kedvezőbben zajlik le, továbbá megnövekszik a vízoldhatatlan enzimkészítmény specifikus aktivitása. Az enzim tisztasága 0,15—50 mikromól/mg protein, célszerűen 1,5—15 mikromól/mg protein érték 40 között van. Abban az esetben, ha az adszorbenst először enzimmel, vagy az enzim és a diamin vagy a diamin és dialdehid együttesével vizes oldatban kezeljük, a 45 megfelelő adszorpció biztosításához 2—24 órára van szükség. Abban az esetben, ha az adszorbenst először dialdehiddel, majd diaminnal, ill. a dialdehid és diamin elegyével együttesen vagy az enzimoldattal kezeljük, a megfelelő adszorpció biz- 50 tosításához szintén 2—24 óra szükséges. A kapcsolódási reakció hőmérséklete 1—37, célszerűen 15—25 °C között van. A találmány szerinti eljárással 6-aminopenicillánsavat állíthatunk elő oly módon, hogy benzil- 55 penicillint vagy fenoximetilpenicillint vízoldhatatlan enzimkészítménnyel kezelünk* 6—9, célszerűen 7—8,5 pH értéken. A fenti eljárás során a vizes oldat pH értékét perjódsav vagy alkáli hozzáadásával biztosítjuk, 60 attól függően, hogy a dezacilezés során milyen oldallánc szabadul fel. Az eljárást célszerűen keverés közben hajtjuk végre. Oszlopreaktort is alkalmazhatunk, ha a rendszert megfelelő sebességgel áramoltatjuk, és ily módon a pH érték csökkenését 65 |elkerüljük, ill. a pH értéket az oszloppel sorbakapcsolt keverőreáktor segítségével beállítjuk. A találmány szerinti enzim-készítmény nemcsak azzal az előnnyel rendelkezik, hogy ismételten felhasználható, hanem az ismételt penicillin bontások után a készítményt újra kinyerve a maradék proteint savas kezeléssel eltávolíthatjuk és ezt követően a fent leírt eljárással a gyantára friss enzimet vihetünk fel. Az így kapott enzim-gyanta készítmény további penicillinhasításokhoz használható fel. Az eljárást az alábbi példák szemléltetik: Az 1—12. példában az adszorbens anyagot a dialdehid hozzáadása előtt enzimmel kezeljük. A 13., 14., valamint a 16—21. példák olyan eljárást írnak le, ahol az adszorbens anyagot az enzim hozzáadása előtt előzetesen dialdehiddel és diaminnal kezeljük. A 15. példában a résztvevő anyagokat egyidejűleg hozzuk össze. A példákban használt Amberlit XAD—7 gyanta a kereskedelemben beszerezhető térhálós metakrilát polimer, amely makro-térhálóval rendelkezik. A példákban és a táblázatokban megadott aktivitás érték a készítmény 1 g-ja által 7,8 pH-n és 37 °C hőmérsékleten percenként előállított 6-aminopenicillánsav mólját jelenti. A példákban a részben tisztított aciláz enzimet oly módon állítjuk elő, hogy az NCIB 8743 Escherichia coli acilázt termelő törzs sejtjeiből mechanikai úton homogenizátor alkalmazásával az enzimet kinyerjük. A sejttöredékeket 5,0 pH-n végzett szűréssel különítjük el. Az enzimet az oldatból ismert eljárással, így ammóniumszulfáttal lecsapjuk, majd vízben újraoldjuk ós ezt követően az oldatot dializáljuk. Az oldatot vagy közvetlenül az adszorpcióhoz használjuk fel, vagy fagyasztással szárítjuk és ezt követően újra oldjuk. Nagyobb tisztaságú enzimet kaphatunk, ha a fentiek szerint előállított enzimoldatot ismert eljárással tovább tisztítjuk; erre a célra ioncserélő kromatografiát vagy hőkezelést alkalmazhatunk. [(Jacoby B.: Methods in Enzymology, XXII. kötet, Acedemie Press (1971.)] 1—7. példák A táblázatban feltüntetett diaminmennyiséget 1500 ml 0,5 mól 5 pH-jú citrát-foszfát puffer-oldatban oldjuk fel. A pH értékét 5,0-re állítjuk, majd a táblázatban feltüntetett mennyiségű penicillinacilázt adjuk hozzá. 100 g Amberlit XAD—7 gyantát hozzáadva az elegyet 18 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük. Az oldathoz 100 ml 50%-os vizes glutáraldehidoldatot adunk, majd a pH-t 5,0 értékre állítjuk. Az elegyet 18 óra hosszat kezeljük, a szilárd terméket szűréssel elkülönítjük, vízzel, 5%-os nátriummetabiszulfit-oldattal ÍM nátriumklorid-oldattal és 7,8 pH-jú 0,5 mól foszfátpuffer-oldattal mossuk. A készítmény aktivitását a táblázatban tüntetjük fel. A fentiekben előállított készítmény megfelelő mennyiségót 6%-os káliumbenzilpenicillin oldat dezacilezésóhez használjuk fel. A decazilezést 1 literes edényben, keverés közben 7,8 pH-n és 37 °C-on végezzük. Az egyes vizsgálatokban az átalakítás hozamát 5 óra után állapítottuk meg. 3