167141. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-helyettesített 7-acilamino-CEF-3-EM-4-karbonsav-származékok előállítására

51 167141 52 3. lépés: Produkciós lépés (az antibiotikum előállítása) A produkciós közeg 1 liter desztillált \ízre számítva 30 g oldható cefrét, 7,5 g primer száraz élesztőt és 0,25 térf.% Mobilpar-S habzásgátló anyagot tartalmaz. A közeg pH-ját kevés tömény nátriumhidroxid-oldattal 7,0-ra állítjuk, majd a közeget Erlenmeyer-lombikba töltjük, a lombikot autoklávba helyezzük, és 15—20 percig 121 C°-on sterilizáljuk. A közeget lehűtjük, és 2,5%, a 2. szakaszban kkpott inokulummal beoltjuk. Az elegyet 50—100 órán át — előnyösen kb. 72 órán át -inkubáljuk. Az egyes lombikokba 30—50 ml tenyésztési közeget — rendszerint 40 ml tenyésztési közeget — töltünk. Az inokulumot 1—5% mennyiségben alkalmazhatjuk, rendszerint 2,5% inokulumot adunk a közeghez. 4. lépés: Az antibiotikum koncentrációjának meghatározása A fermentáció lezajlása után a sejteket centrifugálással elválasztjuk, és a fermentlevet pH = 7,0 értékű foszfátpufferrel hígítjuk. A 3-(karbamoiloximetil)-7|3-(D-5-amino-5-karboxi-valeramido)-7-metoxi-3-cefem-4-karbonsav koncentrációját a fermentlében az ismert biológiai korong-módszerrel hatá rozzuk meg. A meghatározáshoz vizsgálati mikroorganizmusként Vibrio percolans-t (ATCC 8461) használunk. A hígított fermentlébe szűrőpapír-korongokat merítünk, és a korongokat Vibrio percolans-sal (ATCC 8461) beoltott agar-tenyészetet tartalmazó Petri-csészékre helyezzük. Az összehasonlító kísérletekben a Petri-csészékre ismert koncentrációjú 3-karbamoiloximetil-7/3-(D-5--amino-5-karboxi-valeramido)-7-metoxi-3-cefem-4--karbonsav-oldatba merített szűrőpapír-korongokat helyezünk. A rendszert éjszakán át 28 C°-on inkubáljuk, majd meghatározzuk a gátlási zónák átmérőit. Az ismert koncentrációjú oldatokra kapott eredmények alapján kalibrációs görbét veszünk fel, és a kalibrációs görbéből interpolálással meghatározzuk a fermentleben levő termék koncentrációját. A fenti meghatározás szerint a Streptomyces lactamdurans MB—2908 a módosított fermentációs eljárásban 78,6/ig/ml mennyiségű 3-karbamoiloximetil-7/3-(D-5-amino-5-karboxi-valeramido)-7-rnetoxi-3-cefem-4-karbonsavat termel. 5. lépés: Az antibiotikum elkülönítése A szűrt fermentlé pH-értékét híg sósavoldattal 7,0-ra állítjuk, és 2900 ml szűrt fermentlevet 10 ml/perc sebességgel 100 g erősen bázikus anioncserélő gyantát tartalmazó oszlopon (sztirol-divinilbenzol alapú gyanta, Dowex 1x2, klorid-ciklus) bácsátunk át. Az ioncserélt oldatot 500 ml-es frakciókba gyűjtjük. A gyantaoszlopot vízzel mossuk, majd 3% ammóniumkloridot tartalmazó 90%-os metanollal eluáljuk. Az eluátumot 100 ml-es frakciókba gyűjtjük. A frakciókat egyesítjük, az oldatot híg nátriumhidroxid-oldattal pH = 7,2-8,0 értékre lúgosítjuk, majd 14 ml/perc sebességgel 100 g bázikus anioncserélő gyantát (sztirol-divinilbenzol alapú gyanta, Dowex 1 x 2, klorid-ciklus) tartalmazó oszlopon bocsátjuk át. Az oszlopot vízzel mossuk, majd 5%-os vizes nátriumklorid-oldattal eluáljuk. Az eluátumot 50 ml-es frakciókba gyűjtjük, és a frakciókat betöményítjük. Akoncentrátumot 500 ml-re hígítjuk, a 8,8 pH-értékű oldatot híg sósavoldattal pH = 2,0 értékre savanyítjuk, majd 2,5 ml/perc sebességgel 25 ml erősen savas kation-10 cserélő gyantát (sztirol-divinilbenzol alapú szulfonát-gyanta, Dowex 50 x 2, hidrogén-ciklus) tartalmazó oszlopon bocsátjuk át. Az oszlopot 25 ml vízzel mossuk, majd 2%-os piridinnel eluáljuk. Amikor az eluátum pH-értéke 7,0-ra emelkedik j» (kb. 54 ml oldat átáramlása után), az eluálást befejezzük, és az eluátumot híg nátriumhidroxid-oldattal pH = 8,0 értékre lúgosítjuk. A lúgos oldatból vákuumban lepároljuk a piridint. 3-Karbamoiloximetil-7j3-(D-5-amino-5-karboxi-valeramido)-7-metoxi-3-cefem-4-karbonsavat kapunk. Elemzés Ci {.Hji^SOgNa képletre: 25 30 35 50 55 Számított: C -41,0%, H = 4,5%, N = 12,0%, S =6,8%, Talált: C =39,31%. H = 4,76%. N =11,16%. S =6,46%. 25. példa 3-Karbamoiloximetil-7-metoxi-7/3-fenilacetamido-3-cefem-4-karbonsav A) lépés: 3-Karbamoiloximetil-7j3-[(D-5'-triklóretoxikarbonilamino-5'-karboxi-valeril)-fenilacetilamino]-7-metoxi-3-cefem-4--karbonsav -di-benzhi drilészter 9,3 g (10 mmól) 3-karbamoiloximetil-7j3-(D-5-tri >0

klóretoxikarbonilamino-5-karboxi-valeramido)-7-metoxi-3-cefem-4-karbonsav-di-benzhidrilészter, 7,8 g (40 mmól) N-trimetilszilil-ftálimid és 5,3 ml (40 mmól) fenilacetilklorid 50 ml acetonitrillel ké szített oldatát 20 órán át 40 C°-on tartjuk. Az ele-45 gyet szobahőmérsékletre hűtjük, szűrjük, a szűrletet szárazra pároljuk, és a maradékot hexánnal eldörzsöljük. A 3-karbarnoiloximetil-7|3-[(D-5'-triklóretoxika rb onilamino-5 '-karboxi-valeril)-fenilacetilamino]-7--metoxi-3-cefem-4-karbonsav-di-benzhidrilésztert tartalmazó szilárd maradékot tisztítás nélkül használjuk fel a következő lépésben. B) lépés: 3-Karbamoiloximetil-7-metoxi-7|3--fenilacetamido-3-cefem-4-karbonsav-benzhi drilészter Az A) lépésben kapott nyers terméket 50 ml etilacetát, 45 ml ecetsav és 5 ml víz elegyében oldjuk. Az oldathoz 20 g cinkport adunk, és az 60 elegyet 4 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A cink fölöslegét kiszűrjük, és a szűrletet etilacetát és víz között megosztjuk. A szerves oldatot nátriumhidrogénkarbonát-oldattal és vízzel mossuk, szárítjuk, és az oldószert lepároljuk. A kapott nyers 65 terméket 1 kg szilikagélen kromatografáljuk, eluálószerként 47 : 47 : 6 arányú kloroform-hexán-meta-26