167141. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-helyettesített 7-acilamino-CEF-3-EM-4-karbonsav-származékok előállítására
49 167141 50 acetamid elegyét 6 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az illékony anyagokat nagy vákuumban lepároljuk, és a maradékot 3 ml metilénkloridban oldjuk. Az oldathoz 0,23 ml (1,79 mmól) 5 fenilacetilkloridot adunk, és az elegyet 65 órán át szobahó'mérsékleten állni hagyjuk. Az oldatot bepároljuk, és a maradékot 5 ml tetrahidrofurán és 0,7 ml 2,5 n sósavoldat elegyében oldjuk. 20 perc elteltével az oldószert lepároljuk, és a maradékot 10 metilénklorid és vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldat között megosztjuk. A szerves fázist elválasztjuk, nátriumklorid-oldattal mossuk, szárítjuk, majd szárazra pároljuk. A nyers terméket szilikagélen kromatografáljuk, eluálószerként 95 : 5 arányú 15 kloroform-etilacetát elegyet használunk. Vékonyrétegkromatográfiásan egységes terméket kapunk. Hozam: 300 mg. UV. (metanol): \max 2640 /xm (e = 6650). A termék deuterokloroformban felvett NMR- 20 -spektrumában a következő sávok jelennek meg: 0 = 3,50 (O-CH3, s), 3,31 (2-H2 , elmosódott), 4,67 [CH2 (CCl 3 )-0-, s], 5,04 (6-H, s)~4,96 (10-H2 , elmosódott), 3,95 (13-H 2 , s). 25 D) lépés: 3-Karbamoiloximetil-7-metoxi-7|3--fenilacetamido-3-cefem-4-karbonsav-benzhidrilészter 104 mg 3-karbamoiloximetil-7j3-[(D-5'-triklóret- 30 oxikarbonilamino-5'-karboxi-valeril)-fenilacetilamino]-7-metoxi-3-cefem-4-karbonsav-di-benzhidrilészter 1 ml 90%-os ecetsav-víz eleggyel készített oldatához 100 mg cinkport adunk, és az elegyet 5 órán át keverjük. Az elegyet szűrjük, és a szűrletet 35 vákuumban bepároljuk. A maradékot metilénklorid és víz között megosztjuk. A metilénkloridos oldatot nátriumhidrogénkarbonát-oldattal és nátriumklorid-oldattal mossuk, szárítjuk, végül bepároljuk. A nyers terméket szilikagél-vékonyrétegen kroma- 40 tografáljuk, eluálószerként 3 : 2 arányú kloroform-etilacetát elegyet használunk. 17 mg tiszta terméket kapunk. A terméket infravörös és NMR-spektrum alapján azonosítjuk. A termék kloroformban felvett infravörös spektrumában a követ- 45 kező sávok jelennek meg: 1780, 1730, 1680 cm-1 . UV (metanol): Xmax . = 2640;um (e = 5870). A termék deuterokloroformban felvett NMR-spektrumában a következő sávok jelennek meg: 5 = 3,40 (0-CH3 , s), 3,33 (2-H 2 , elmosódott), 5,01 (6-H, 50 s), 4,88 (10-H2 , elmosódott), 3,60 (13-H 2 , s). E) lépés: 3-Karbamoiloximetil-7-metoxi-7|3--fenilacetamido-3-cefem-4-karbonsav 55 17 mg 3-karbamoiloximetil-7-metoxi-7/3--fenilacetamido-3-cefem-4-karbonsav-benzhidrilésztert 0,2 ml anizolban oldunk, és az oldathoz 0,5 ml trifluorecetsavat adunk. 5 perc elteltével az elegyet nagy vákuumban hirtelen bepároljuk, és a 60 maradékhoz etilacetátot adunk. Az etilacetátos oldatot nátriumfoszfát-pufferoldattal (pH = 7,5) extraháljuk. A vizes oldatot híg sósavoldattal pH = 2,5 értékre savanyítjuk, és a savas oldatból etilacetáttal kivonjuk a terméket. Az etilacetátos oldatot szá- 65 rítjuk, majd bepároljuk. A kapott termék mintáját etilacetátból átkristályosítjuk. 159-161 C°-on olvadó, analitikai tisztaságú terméket kapunk. Hozam: 60%. UV (pufferoldat, pH = 7): \max .2670/xm (e = 8650). A termék cianometánban felvett infravörös spektrumában 1780, 1735 és 1700cm_1 -nél jelennek meg jellemző sávok. Az NMR-spektrum sávjai (oldószer: CD3 CN + D 2 0): 5 = 3,42 (O-CH3, s), 3,35 (2-H2 , elmosódott), 5,01 (6-H, s), 4,83 (10-H2 , d), 3,01 (13-H 2 , s). Elemzés C18 H 19 07N 3 S képletre: Számított: C =51,29%, H =4,54%, Talált: C =51,47%., H=4,73%. 10 mg, a fenti lépésben előállított savat egy csepp metanolban oldunk, és az oldathoz 2 mg dibenzil-etiléndiamin-diacetát etilacetátos oldatát adjuk. Tűkristályos, 140-143 C°-on olvadó 3-kar-bamoiloximetil-7-metoxi-7j3-fenilacetamido-3-cefem-4-karbonsav-dibenziletiléndiaminsót kapunk. UV (metanol): Xmax . 263 nm (e = 8600). 3-Karbamoiloximetil-7|3-(D-5-amino-5-karboxi-valeramido)-7-metoxi-3-cefem-4-karbonsav-mononátriumsó előállítása módosított fermentációs eljárással 1. lépés: Ferde tenyészet előállítása Liofilizált Streptomyces lactamdurans (MA-2908) tenyészetet tartalmazó ampullát aszeptikus körülmények között felnyitunk, és a mikroorganizmust a következő összetételű táptalajra helyezzük: 1% melasz 1% sör élesztő 2,5% Difco-agar (pH = 7,0) víz. A ferde tenyészeteket 7 napig 28 C°-on tartjuk. Ha a tenyészeteket hideg helyen tároljuk, 13 hétnél hosszabb ideig is eltarthatok. 2. lépés: Oltás két szakaszban Első szakasz: 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba 1%-os, primer száraz élesztőt, (a Yeast Product Corporation cég terméke) tartalmazó 40 ml közeget töltünk (pH = 7,0), és a közeget az 1. lépésben kapott ferde tenyészettel beoltjuk. A lombikot 4,8 cm lökethosszú, 200 fordulat/perc forgássebességű rázógépre helyezzük, és az elegyet 2—3 napig 28 C°-on inkubáljuk. Második szakasz: 2% Fleischmann S-l5 élesztő-autolizátumot tartalmazó, 7,0pH-értékű közeghez 2,5%, az első oltási szakaszból származó inokulumot adunk, és az elegyet az első szakaszban ismertetett körülmények között legföljebb 48 órán át inkubáljuk. Jellegzetes, világos színű telepek képződnek. 25
