167121. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú gentamicin c komplex és/vagy gentamicin c komponensek előállítására
7 167121 8 komponensarányú, így előállított gentamicin-szulfát biológiai aktivitása mintegy 10%-kal múlja felül annak hatékonyságát, a gentamidn C2 szulfátjának biológiai aktivitása (710 gamma/mg) pedig mintegy 23%-kal múlja felül a kereskedelmi forgalomba levő gentamidn-készítmény (Garamion) hatékonyságát. A találmány szerinti eljárásban a gentamidnC komplex, illetve egyes komponenseinek meghatározását agardiffúziós módszerrel Staphylococcus epidermidis tesztorganizmus felhasználásával, gentamidn-C standarddal összehasonlítva állapítjuk meg. Az egyes gentamidn-C komponensek meghatározását az irodalomban ismertetett módszerrel [J. Pharm. Sei. 57, (12)2170-2171 (1958)] papírkromatográfiás elválasztás után mikrobiológiai úton, illetve esetenként kémiai módszerrel, ninhidrin-színreakdó felhasználásával vagy papír- ill. rétegkromatográfiás elválasztás után közvetlen denzitometriás módszerrel határozzuk meg. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg: 1. példa A Micromonospora echinospora 15 837 (NRRL 2985) sugárgomba törzs szokásos úton végzett tenyésztésével kapott 1000 liter, oxálsawal kaldummentesített, leszűrt erjesztéses oldathoz, mely 520 gamma/mg gentamidn C-t tartalmaz, annyi 10%-os nátriűmhidroxid-oldatot adunk, hogy az elegy pH-ja 7,5 legyen, majd szükség esetén az oldatot megszűrjük. Az így kapott éles oldatot három oszlopból álló, sorbakapcsolt, egyenként 3-3 liter nátrium-formájú (Wofatit CP-300) gyantát tartalmazó oszloprendszeren (oszlopátmérő 8 cm, gyantarétegmagasság 60 cm) folyatjuk át 50 liter/óra sebességgel. Azátfolyatás befejezésekor az első oszlop gyakorlatilag telítődik gentamicinnel, vagyis az ezen az oszlopon átfolyó oldat körülbelül 500 gamma/ml gentamidn C-t tartalmaz. Az erjesztéses oldatban levő gentamidnC mennyiségének mintegy 15%-a a második oszlopon kötődik meg. A második oszlopról elfolyó oldat a megkötés befejezésekor mintegy 5-10 gamma/ml gentamidn C-t tartalmaz. Ezt az oszlopot a gentamidn teljes kinyerése érdekében folyamatos üzemmenet esetén további friss gentamidn C tartalmú oldattal telítjük. Az első gyantaágyat 25 liter desztillált vízzel átmossuk, majd a gentamidn C-t 0,5 liter/óra sebességgel 4,0 n kénsawal oldjuk le. A gentamidn C tartalmú oldatokat, melyek lOOOgamma/ml-nél nagyobb koncentrációban tartalmazzák a gentamidn C-t, egyesítjük. Dy módon 5500 ml 73 000 gamma/ml gentamidn C-t tartalmazó oldatot kapunk. Az oldatban levő gentamidn C-nek 30%-á Ci, 45%-a C2 és 25%-a Ci a . A sötétbarna színű, erősen savas eluátum pH-ját (trietilaminnal) 7,5-re állítjuk be, az oldathoz 80 g aktív szenet adunk, és 30 perces keverés után az oldatot megszűrjük, majd a szenet kétszer 200 ml desztillált vízzel mossuk. így 5900 ml 66 000 gamma/ml gentamidn C tartalmú oldatot kapunk. Ezt az oldatot 10 liter ammónium-formájú (Amberlite CG-50II) gyantát tartalmazó, 12 cm átmérőjű oszlopra visszük. Az oszlopot ezután 40 liter desztillált vízzel átmossuk. Az oszlop eluálá-5 sát sorrendben 40—40 liter ionmentes vízzel készített 0,1, 0,125, 0,15, 0,175, 0,20, 0,25 és 0,30 n, majd 25 liter mennyiségű 0,5 n ammómumhidroxid-oldatokkal végezzük. Azeluálás sebessége 5 liter/óra. Azeluálásnál 5—5 liter frakdókat szedünk. 10 Az egyes frakdók hatóanyagtartalmát rétegkromatográfiás módszerekkel ellenőrizzük. A gentamidn C mellett jelenlevő szennyeződéseket az 1-től 35-ig és az 56-tól 60-ig terjedő frakciók tartalmazzák. 15 A 35-38. frakdókat egyesítjük és vákuumban 60-65 C°-on szárazra pároljuk. A víznyomokat benzol: etanol 1 :1 elegyével eltávolítjuk, és a fehér színű párlási maradékot vákuumban foszforpentoxid felett 60C°-on súlyállandóságig szárítjuk. 20 így 65 g gentamidn C2 -t kapunk. A termék gentamidn C2 tartalma 98-99%, C1 tartalma maximum 1%. Elemi analízise: C: 50,85%, H: 9,02%, N: 14,83%, 25 hamu:0. Optikai forgatóképessége: (a)£>s = +165° (1%, víz). Biológiai hatékonysága: 1235 gamma/mg. A biológiai hatékonyság értékét minden esetben a ke-30 reskedelmi forgalomban levő gentamidn-szulfátra vonatkoztattuk. Mágneses magrezonancia spektruma az 1. ábrán látható. A 39—45. frakdókat egyesítve, a fentiek szerint 35 259,3 g gentamidn C komplexet kapunk. A termék összetétele: 35% C1( 39% C 2 , és 26% C ia . Elemi analízise: C: 51,02%, H: 8,95%, N: 14,70%, hamu: 0. Optikai forgatóképessége: (a)f)S =+161° (1%, 40 víz). Biológiai hatékonysága: 1096 gamma/mg. A 46-48. frakciókat egyesítve, a fentiek szerint 31,2 g gentamidnC komplexet kapunk. A termék összetétele: 41% Cj, 10% C2 és 49% Ci a . 45 Optikai forgatóképessége: (a)f>5 = +154° (1%, víz). Biológiai hatékonysága: 985 gamma/mg. A 49—55. frakdókat egyesítve, a fentiek szerint 9,8 g gentamidn Cia-t kapunk. A termék össze-50 tétele: 5% gentamidn d, 1% C2 és 94% Ci a . Elemi analízise: C:49,9%, H:8,85%, N:15,2%. Optikai forgatóképessége: (a)&5 =+158° (1%, víz). Biológiai hatékonysága: 1030 gamma/mg. 2. példa Az 1. példa szerinti módon a 39-45. frak-60 dókból nyert gentamidnC komplexből 10g-ot 50 ml desztillált vízben oldunk, és az oldat pH-ját 5n kénsawal 4,5-re állítjuk be. Az oldatot 2g aktív szénnel derítjük, majd 500 ml metanolba csurgatjuk. A csapadékos elegyet 24 órán át 65 0C°-on állni hagyjuk, majd megszűrjük, és 4
