167121. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú gentamicin c komplex és/vagy gentamicin c komponensek előállítására
9 167121 10 vákuumban foszforpentoxid felett súlyállandóságig szárítjuk. Ilyen módon 13,8 g, 668 gamma/mg hatékonyságú gentamicin C szulfátot kapunk. Elemi analízise: C: 32,21%, H: 7,05%, N:9,22%, S04 : 31,88%. Optikai forgatóképessége: (a)&5 =+121° (1%, víz). Az 1. példa szerinti módon a 35-38. frakciókból nyert gentamicin C2 -ből 10g-ot a fentiek szerint szulfáttá alakítva, 13,3 g, 710 gamma/mg hatékonyságú gentamicin C2 szulfátot kapunk. Elemi analízise: C: 31,92%, H: 7,25%, N:9,28%, S04 :32,25%. Optikai forgatóképessége: (a)£,s = +124° (1%, víz). 3. példa Az 1. példa szerinti módon kapott gentamicin C komplexből (46-48. frakció) 10 g-ot feloldunk 100 ml ionmentes vízben, és az oldatot 5 cm átmérőjű és 75 cm magasságú, ammónium-formájú karboximetil-Sephadex C-25 gélt tartalmazó kromatografáló oszlopra visszük. Az oszlopot 500 ml vízzel mossuk, majd 0,1—0,3 n ammóniumhidroxiddal gradiens eluciós kromatográfiai végzünk. A leoldás sebessége 5 ml/perc. összesen 200 20-20 ml-es frakciót szedünk. A gentamicin Ci á és a gentamicin C2 a 7,5-95. frakcióban eluálódik, míg a Ci a 110-130. frakciókban. Ezeket a frakciókat egyesítjük, vákuumban szárazra pároljuk és benzol: etanol 1 :1 elegy segítségével vízmentesítjük. így 3,7 g gentamicin Cx -et kapunk. Hatóanyag tartalma: 890 gamma/mg. Optikai forgatóképessége: (a)" =+153° (1%, víz). Mágneses magrezonancia spektruma a 2. ábrán látható. 4. példa Az 1. példa szerinti módon kapott 4,0 n kénsavas eluátum 1000 ml-éhez annyi trietilamint adunk, hogy az oldat pH-ja 2,0 legyen. Ezután az oldathoz annyi metanolt adagolunk, hogy a keletkező zavarosodás még éppen eltűnjön (körülbelül 300-500 ml metanol szükséges). 10 g aktív szén hozzáadása után az elegyet 15 percig keverjük, majd szűrjük, és a szűrlet pH-ját trietilaminnal 4,5-re. állítjuk be. Az oldatot ezután állandó keverés közben 5 liter metanolba csurgatjuk. A kivált nyers gentamicin-szulfátot szűrjük, 2 x 200 ml metanollal mossuk és vákuumban szárítjuk. így összesen 131 g nyers gentamicin-szulfátot kapunk. Biológiai hatékonysága: 520 gamma/mg. Hamutartalma: 2,2%. Optikai forgatóképessége: (a)" = +103° (1%, víz). A fenti nyers gentamicin-szulfátból 100 g-ot ' 500 ml ionmentes vízben feloldunk, majd az oldat pH-ját trietilaminnal 7,5-re állítjuk be. A kapott oldatot 5 g szénnel derítjük, szűrjük és a szűrletet 2,2 liter ammónium-formájú kationcserélő (Amberlite IRP-64) gyantát tartalmazó oszlopra visszük. Az oszlop átmérője 6 cm, magassága 80 cm. A gyantát az 1. példában leírtakhoz hasonlóan 10 liter ionmentes vízzel mossuk, majd a gentamicin C-t 5 10-10 liter térfogatú 0,1, 0,13, 0,16, 0,19, 0,22, 0,25 és 0,30 n ammóniumhidroxid-oldatokkal oldjuk le. A leoldás sebessége 500 ml/óra. A frakciók térfogata l-l liter. A 31-35. frakcióból az 1. példában leírtakhoz hasonló módon 10,2 g 99% 10 tisztaságú gentamicin C2 -t kapunk. A 36-57. frakciókból 38,9 g gentamicin C-t kapunk. Összetétele: 39% C, 35% C2 , 22% Cia. Az 58-64. frakciókból 5,1 g gentamicin Cia -t kapunk. Összetétele: 3% Ci, 1% C2 , 96% Cia-5. példa Az 1. példa szerint előállított, pH = 7,0-ra semle-20 gesített és aktív szénnel derített 4,0 n kénsavas eluátum 500 ml-ét (hatóanyagtartalma 71 000 gamma/mg) 1,2 liter 8%-os vizes trietilamin-oldattal, majd desztillált vízzel semlegesre mosott, trietilamin-formában levő (Amberlite CG—50—II) oszlopra 25 visszük. Az oszlop átmérője 5 cm, magassága 60 cm. A gyantaágyat ezután az 1. példában leírtakhoz hasonlóan 5 liter ionmentes vízzel mossuk, majd a gentamicin C eluálását sorrendben 3—3 liter térfogatú 1,0, 1,3, 1,6, 2,0, 2,4, 2,8, 3,2, 4,0 és 6,0 30 súlyszázalék trietilamint tartalmazó vizes oldatokkal végezzük. A leoldás sebessége 150 ml/óra. A frakciók térfogata 500 ml. A 28-38. frakciókból 31,3 g 99,5% tisztaságú gentamicin C bázist kapunk. Összetétele: 32% d, 48% C2 , 20% Cia- A 39-40. frak-35 dókból 2,1 g gentamicin Cia -t kapunk. Összetétele: 98% Cia, 1%C2 , l%Ci. Szabadalmi igénypontok: 40 1. Eljárás nagytisztaságú gentamicin C komplex és/vagy gentamicin Ci, gentamicin Cia és gentamicin C2 , valamint ezek sóinak előállítására vizes oldatokból, célszerűen Micromonospora fajok, elő-45 nyösen a Micromonospora echinospora faj törzsei által termelt erjesztéses oldatokból a gentamicin C komplexnek nátrium- vagy ammóniumformájú, poliakrilsav- vagy polimetakrilsav-vázas karboxil-típusú kationcserélő gyantán végzett megkötése útján, azzal 50 jellemezve, hogy a gyantán megkötött gentamicin C komplexet erős ásványi sav 2,5—5,5 n vizes oldatával, célszerűen 3,5—4,5 n kénsawal leoldjuk és a kapott eluátumot vagy a gentamicin C tartalmú vizes oldatot 5-11 pH értéken, célszerűen 7,0-9,0 pH 55 értéken a) ammónium-formában levő karboxil-típusú kationcserélő gyantán megkötjük, majd a gentamicin C komplex komponenseit illékony ammóniumbázisok 60 0,05 n és 1,0 n között fokozatosan növekvő koncentrációjú, előnyösen 0,05—0,30 n koncentrációjú vizes oldatainak segítségével egymást követően gentamicin C2 , gentamicin Ci, gentamicin Ci a sorrendben leoldjuk, és a külön frakciókban szedett 65 tiszta gentamicin C komplexet vagy gentamicin C2 -t, 5
