167086. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nem antigén hatású, a gazdaszervezet természetes ellenállóképességét serkentő vírustörzsek és vakcinák előállítására
5 167086 6 Sertéseknek intramuszkulárisan beadva 0,5-10 ml, előnyösen 1,5-5 ml fenti koncentrációjú vakcina bizonyult előnyös adagnak, míg spray-alakban 1,5-10 ml, előnyösen 2-5 ml-t alkalmazunk. • 5 Az alábbi példákban részletezzük a találmány szerinti eljárást néhány vírus példáján, megjegyezzük azonban, hogy az eljárás bármely vírusra alkalmazható. 1. példa A hólyagos kiütés (Exanthema coitale vesiculosum bovis) kórokozója közönséges vírustörzset az 15 alábbi módon izoláljuk megbetegedett szarvasmarha nyálhártyáiról. Steril géztampont bevezetünk a megbetegedett szarvasmarha hüvelyébe. A hüvelyváladékkal átita- 20 tott tampont steril Erlenmeyer-lombikba helyezzük, és a váladék mennyiségét méréssel megállapítjuk. Milliliterenként 1000 N. E. penicillint és 1000 7 streptomicint tartalmazó Earl-féle laktalbumin-hidrolizátum-közegből 9tf-részt adunk a 25 tamponhoz, majd a lombikot 4 C°-on 1 órán keresztül rázzuk. Utána a tampont kinyomjuk az extraktumot hűtőcentrifuga segítségével 4C°-on 3000 perc-1 fordulatszám mellett kétszer 30 percen át centrifugáljuk, és a kapott felülúszó részt 30 membránszűrővel sterilre szűrjük. A steril vírusextraktumot hordozómentes zónaelektroforézis útján tisztítjuk, majd a víruspopuláció egységességét megvizsgáljuk. 35 Roux-palackban tenyésztett primer borjúvesesejtkultúrához laktalbumin-hidrolizátumot és 1-10% vírusextraktumot tartalmazó Earl-féle közeget adunk, majd 36—40C°-on tartjuk. Amikor a sejttenyészet 80—100%-a elpusztult (citopatogén 40 effektus), azaz mintegy 24-72 óra után a felülúszó részt dekantáljuk és 4C°-on 2000 g mellett 40 percen át centrifugáljuk. Az elválasztott sejtmaradékot megsemmisítjük, a folyadékot friss primer borjúvesesejt-kultúrára visszük át a fen- 45 tiekben megadott módon. A folyamatot 450-szer megismételjük, ami mintegy 3 évet vesz igénybe. A vírus virológiái és immunológiai tulajdonságait időközönként megvizsgáljuk. 50 A hígítással 107,2 KiD-egységre beállított anyagot az állatok légzőrendszerének és nemiszerveinek nyálhártyáira visszük fel. Klinikai tünetek nem mutatkoznak. Az oltás után 4 héttel az általában szokásos módszerekkel a kiindulási vírussal reagáló 55 antitesteket nem lehet kimutatni (az antitestek kimutatására szokásos módszerek a szérumsemlegesítési kísérlet, a kettős diffúziós módszer és az immunelektroforézis). Az interferon képződése azonban kimutatható. (Az interferon kimutatására 60 a foltképzés csökkentésének módszere, a vírus hemagglutinin-titere csökkenésének módszere és a kvantitatív hemadszorpciós módszer alkalmas). Az interferon védi az állatokat virulens vírussal való fertőzéstől. 65 2. példa 4 csordában, .éspedig egy mesterséges megtermékenyítő állomáson és 3 tenyésztő gazdaságban az állatok egyrészt köhögtek, másrészt nem specifikus, kimutathatóan nem vírus okozta fertőzésük volt a nemi szerveken. Az 1. példában leírt, az interferontermelést serkentő vírustörzzsel oltva az állatok néhány hét alatt meggyógyultak. Kiindulási vírus elleni antitest nem képződött. 3. példa Megbetegedett sertéstől az AUJESZKY álveszettség S/T vírustörzset az alábbiak szerint különítjük el. Egy, virémiás tüneteket mutató malacot megölünk, és steril körülmények között szövetmintát veszünk az agyvelőből. A sejtszövetet 4 C°-os steril foszfátpuffer-oldattal kétszer mossuk, majd ollóval feldaraboljuk. A szövetdarabokhoz steril tengeri homokot és 4tf-rész hideg foszfátpuffer-oldatot adunk, és az elegyet mozsárban eldörzsöljük. 30 percen keresztül hűtőcentrifuga segítségével 4C -on 3000 perc-1 fordulatszám mellett centrifugálva a homokot és a szövetet elválasztjuk a vírustartalmú folyékony fázistól. A felülúszó részt a fenti feltételek mellett még egyszer centrifugáljuk, és a kapott extraktumot membránszűrővel sterilre szűrjük. Roux-palackban tenyésztett BHK-21 sejtkultúrához [BHK-21: hörcsögvesesejt-tenyészet, vö.: STOKER M. és MACPHERSON I.: Syrian hamster fibroblast cell line BHK-21 and its derivatives. Nature (Lond.) 203, 1355-1357 (1964)] 1-10% vírusizolátumot tartalmazó Eagle féle közeget adunk, majd 36-40 C°-on tartjuk. Amikor a citopatogén effektus bekövetkezett, azaz a sejttenyészet 80-100%-a elpusztult (24-48 óra), a felülúszó részt dekantáljuk és 4C°-on 2000 g mellett 30 percen át centrifugáljuk. Az elválasztott sejtmaradékot megsemmisítjük, míg a folyadékot friss BHK-21 sejtkultúrára visszük át. A folyamatot 300-szor megismételjük, ami körülbelül 2 évet vesz igénybe. A vírus virológiái és immunológiai tulajdonságait időközönként megvizsgáljuk. A kapott anyaggal a légzőrendszerben nem specifikus, malacinfluenza-szerű megbetegedéseket mutató sértéseket részben intramuszkulárisan, részben az orron keresztül oltunk. A kezelt állatoknál a betegség tünetei 3 hét alatt teljesen eltűnnek, míg a kontrollállomány beteg marad. Specifikus immunitás a kiindulási vírussal szemben nem alakul ki. 4. példa Influenzás ember orrából géztampon segítségével orrváladékot veszünk, és a gézdarabot steril Erlenmeyer-lombikba helyezzük. A váladék meny -nyiségét megállapítjuk, utána 9tf-rész, milli- í literenként 1000 NE penicillint és 1000 y streptomicint tartalmazó hideg foszfátpuffer-oldatot adunk hozzá. A lombikot 4C°-on 1 órán át 3
