167086. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nem antigén hatású, a gazdaszervezet természetes ellenállóképességét serkentő vírustörzsek és vakcinák előállítására
7 167086 8 rázzuk, víána a gézt kinyomjuk. Az extraktumot hűtőcentrifugában 4C°-on 3000 perc-1 fordulatszám mellett kétszer 30 percen át centrifugáljuk és a felülúszó részt membránszűrő segítségével sterilizáljuk. s Az extraktumban levő vírustörzset 10 szakaszon át embriót tartalmazó tyúktojásban tenyésztjük, majd a vírustartalmú allantoid-folyadékot ultracentrifugával betöményítjük. Roux-palackban tenyésztett primer majomvesesejt-kultú- 10 rához 10-20% víruskoncentrátumot tartalmazó 199 sz. közeget adunk (Medium 199, például por alakjában kereskedelemben kapható szövettenyészet-közeg. Gyártó: GIBCO, Grand Island, N. Y. USA és Flow Laboratories GmbH, Bonn, NSzK), 15 majd 36-40 C°-on tartjuk. Amikor a sejttenyészet 80-100%-ax elpusztult (azaz mintegy 24-72 óra után) a felülúszó részt dekantáljuk és 4C°-on 2000 g mellett 40 percen át centrifugáljuk. Az elválasztott sejtmaradékot megsemmisítjük, és a 20 folyadékot ultracentrifugálással betöményítjük. Az így kapott koncentrátumot friss majomvesesejt-kultúrákra visszük át. A leírt folyamatot 10-szer megismételjük, utána az ultracentrifugálással történő betöményítés már mellőzhető. A vírust to- 25 vábbi 340 szakaszon át tenyésztjük, amikor is mindig a 2000 g mellett centrifugált felülúszc részt visszük fel friss majomvesesejt-kultúrára. Az egész legyengítés mintegy 3 évet vesz igénybe. A vírus virológiái és immunológiai tulajdonságait 30 időközönként megvizsgáljuk. A leírt módon legyengített vírus oldatával 20, az A-FM1 vírussal szemben 1 :32 értéknél kisebb szérumantitest-titerrel rendelkező, 30 és 35 40 év közötti életkorú kísérleti személyt oltunk. Az oldat milliliterenként 500 CCA (Chicken cell agglutinating) egységet tartalmaz. 10 személynél intranazálisan, 10 személynél szubkután módon végezzük az oltást. 40 Az oltás után 4 nappal mind az oltott személyeket, mind a 10 azonos életkorú, szintén 1 :32 értéknél kisebb szérumantitest-titerrel rendelkező személyt is az orron keresztül milliliterenként 500 CCA-egység patogén A 1-FMi vírust 45 tartalmazó oldattal fertőzzük. (AzAl-FM, vírus az ATCC-ben, Rockeville, Maryland, USA, van letétben.) A mellékelt ábrák függőleges tengelyén a szérumantitest-titert, a vízszintes tengelyén a kísér- 50 leti személyek sorszámát tüntettük fel. Az 1. ábra függőleges tengelyén a 20 kísérleti személy oltás előtti szérumantitest-titere látható. A 2. ábra ugyanazt a titert 14 nappal az aktív 55 vírusfertőzés után mutatja. Az oltott személyek védettek voltak a fertőzéssel szemben, míg a 10 kontrollszemély közül kilencen mutatkoztak az influenza tünetei. A 3. ábra a 10 kontrollszemély fertőzés előtti 60 szérumantitest-titerét mutatja. A 4. ábrán a fertőzés után 14 nappal mért szérumantitest-titert tüntettük fel. Csupán a 6. számú kontrollszemély esetén nem lehetett megállapítani az influenza tüneteit. 65 Az oltott személyek szérumában a vírus-specifikus antitest-titer nem emelkedett (2. ábra). Ezzel szemben a betegségből felépült kontrollszemélyek szérumában az A 1-FM 1 vírus elleni antitest-titer 1 :32 és 1 :48 között volt (4. ábra). 5. példa A száj- és körömfájásban megbetegedett szarvasmarha szájüregében levő kóros képződményeket steril ollóval és csipesszel eltávolítjuk, majd Petricsészébe helyezzük. Súlymegállapítás után az anyagot hideg foszfátpuffer-oldattal kétszer mossuk, majd ollóval feldaraboljuk. A szövetdarabokat súlyuktól függő mennyiségű steril tengeri homokkal keverjük, 4tf-rész hideg foszfátpuffer-oldatot adunk hozzá, és az elegyet mozsárban eldörzsöljük. 30 percen keresztül hűtőcentrifugában 4C°-on 3000 perc-1 fordulatszám mellett centrifugálva a homokot és a szövetet elválasztjuk a vírustartalmú folyékony fázistól. A felülúszó részt azonos térfogatú kloroformmal 4C°-on 15 percen át kirázzuk. Az elegyet a fenti körülmények mellett ismét centrifugáljuk, és a kapott felülúszó részt membránszűrő segítségével sterilizáljuk. Roux-palackban tenyésztett primer borjúvesesejt-kultúrához 1-10% vírusextraktumot tartalmazó Hanks-félé közeget adunk, majd 36—40 C°-on . tartjuk. Amikor a sejttenyészet 80-i00%-a elpusztult (azaz 24-36 óra után), a felülúszó részt dekantáljuk és 4C°-on 2000 g mellett 20 percen át centrifugáljuk. Az elválasztott sejtmaradékot megsemmisítjük, és a folyadékot friss borjúvesesejt-kultúrára visszük át. A folyamatot 615-ször megismételjük, ami körülbelül 2,5 évet vesz igénybe. A vírus virológiái és immunológiai tulajdonságait időközönként megvizsgáljuk. A fentiek szerint legyengített vírus milliliterenként 106 ' 5 KiD S0 egységet tartalmazó oldatával 20 db egeret kezelünk intraperitoneális úton, amikor is egerenként 0,5 ml oldatot használunk. A kezelés után 48 órával az egereket Semlicki-Forest-vírussal (0,1 ml, 103 LD 50 ) fertőzzük meg. (A Semlicki—Forest-vírus a Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere Intézetben, Tübingen,NSzK, van letétben.) A legyengített száj-és körömfájás vírussal nem kezelt kontroliegér a fentiekben megadott dózisú Semlicki-Forest-vírussal végzett megfertőzés után elpusztul. A fenti példából kitűnik, hogy a legyengített vírusból készült oldat más vírussal végzett fertőzés ellen is hatékony, a találmány szerinti módon legyengített vírus tehát nem a vírus-specifikus védőmechanizmust, hanem a nem specifikus interferonképződést serkenti. 6. példa A Stomatitis vesicularis (VSV) tüneteit mutató szarvasmarha felső ajkáról steril ollóval és csipesszel hámdarabokat és ulcera-t veszünk le, majd steril Petricsészébe helyezzük. Súlymeghatározás után az anya-
