166890. lajstromszámú szabadalom • Eljárás FC-126 pulykaherpesvírus és Marek-betegséget okozó JM GA vírus stabil szuszpenziójának és liofilizátumának előállítására

3 vakcinák előállítására, valamint eljárás a megfertőzött sejtekből kivont vírusok stabilizálására. A találmány szerint úgy járunk el, hogy az említett vírussal megfertőzött, vírusforrásként használt csirkevese- vagy csirkeembrió-kötőszövet-tenyészet sejtjeit 0,01—45%-ban valamely fehérjét, előnyösen albumint vagy kazeint, 0,2—40%-ban keményítőt vagy valamely keményítőhidrolizátumot, 0,001— 1 mól/liter pufferanyagot és 0,01—20%-ban valamely aminosav-sót tartalmazó stabilizaloszerrel elegyítjük 0,05—1,0%, a sejtek illetve a stabilizálószer szárazanyagát tekintve 5:1 és 100:1 közötti aránynak megfelelő mennyiségben, a megfertőzött sejtekből és a stabilizálószerből homogén szuszpenziót képezünk, a homogén szuszpenzióban levő sejteket ismert módon, előnyösen ultrahanggal szétroncsoljuk, a sejtekből így felszabadított érintetlen életképes vírusokat elkülönítjük, szuszpendáljuk, és kívánt esetben a kapott szuszpenziót liofilizálással feldolgozzuk. Stabilizálószerként a találmány szerint bármilyen anyagot vagy anyagkeveréket felhasználhatunk, amely a vírusra védőhatást fejt ki. (Ez a védőhatás, legalábbis részben, olyan jellegű, hogy a stabilizálószer a sejtek szétroncsolása során és/vagy után nagy vírus-koncentrációt biztosít.) A fenti célra valamely fehérjét, pl. albumint vagy kazeint használhatunk fel. A sejtmentes vírusból és stabilizálószerből álló elegyekhez — elsősorban akkor, ha az elegyeket liofilizálni kívánjuk —• előnyösen keményítőt vagy keményítő-hidrolizátumot is adunk. A készítmények egyéb adalékanyagokat, pl. puffer-anyagokat is tartalmaznak. Albuminforrásként előnyösen a könnyen beszerezhető szarvasmarha-szérumot, míg kazein-forrásként előnyösen lefölözött tejet alkalmazhatunk. Stabilizálószerként természetesen egyéb fehérjéket is felhasználhatunk. A fehérjetartalmú stabilizálószer és a stabilizálandó megfertőzött sejtek aránya a sejtanyagok sűrűségétől, a jelenlévő vírus relatív koncentrációjától, és egyéb hasonló tényezőktől függően változik. Általában a stabilizálószert száraz por vagy híg vizes oldat alakjában adjuk a sejtes anyagokhoz, és az elegyet alacsony hőmérsékleten gondosan összekeverjük. így a sejtanyagot homogén szuszpendáljuk a stabilizálószerben. Általában úgy járunk el, hogy a megfertőzött sejtanyagot a fehérje vizes oldatában oldjuk. A vizes oldat a fehérjét kb. 0,1 vegyes % mennyiségben tartalmazza. A koncentrációt úgy számítjuk ki, hogy,a fehérje grammban kifejezett száraz súlyát osztjuk a sejtanyag szuszpendálására felhasznált folyadék milliliterben kifejezett térfogatával. Homogén folyékony szuszpenzió előállításához kisebb mennyiségű (pl. 0,05 vegyes %) stabilizálószert is felhasználhatunk, a fehérje koncentrációja azonban pl. 1 vegyes %-ig is terjedhet. Természetesen a fehérjét nagyobb koncentrációban is alkalmazhatjuk mindaddig, amíg az a vizes közegben lényegében oldva marad. Az előzőekből nyilvánvaló, hogy a fehérje koncentrációját úgy választjuk meg, hogy a stabilizálószer a sejtanyaggal homogén szuszpenziót képezzen. Egyes esetekben — pl. meghatározott víruskoncentrációjú készítmények előállítása során — a 4 sejtanyag koncentrációját előre megadott értékre kell beállítanunk. A fehérjetartalmú stabilizálószer védőhatása a fent ismertetett koncentrációhatárokon belül gyakorlatilag változatlan marad. 5 A liofilizálásra kerülő sejtmentes víruskészítmények vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy a sejtmentes, száraz víruskészítmények hatásossága tovább fennmarad, ha a folyékony készítményhez, a liofüizálás előtt keményítőt vagy keményítő-10 hidrolizatumot vagy ilyen vegyületek elegyét adjuk. A keményítőt vagy keményítő-hidrolizátumot hozzáadhatjuk külön is a sejtmentes készítményhez vagy a sejtanyag elroncsolása előtt az említett stabilizálószert tartalmazó sejtanyag-szuszpenzió-15 hoz. A fehérjével gyakorlatilag bármilyen keményítő-hidrolizátumot elegyíthetünk, így pl. a száraz, sejtmentes víruskészítmények hatásosságának fenntartása vagy fokozása érdekében (elsősorban a liofilizálásra kerülő készítmények esetén) a fehérjéhez 20 szacharózt, dextránt vagy glükózt adhatunk. A keményítő hidrolizátumok közül a szacharóz bizonyult a legelőnyösebbnek. Nagy víruskoncentrációjú liofilizált, sejtmentes víruskészítmények előállításához már igen kis mennyiségű (kb. 2 vegyes%) 25 keményítő vagy keményítő-hidrolizátum is elegendő. A koncentráció kiszámításakor a keményítő vagy keményítő-hidrolizátum grammban kifejezett száraz súlyát osztjuk a vizes oldat milliliterben kifejezett térfogatával. A keményítőt vagy a kemé-30 nyítő-hidrolízátúmot természetesen nagyobb koncentrációban is alkalmazhatjuk. A fehérje és a keményítő vagy a keményítő-hidrolizátum koncentrációjának aránya a nagy koncentrációjú, száraz, sejtmentes víruskészítmények előállítása szempontjá-35 ból közömbös. így pl. sejtmentes vírustartalmú készítmény homogén szuszpenziójának előállításához tetszés szerinti mennyiségű stabilizálószert felhasználhatunk, feltéve, hogy azok homogén szuszpenziót képeznek, és a szuszpenzióhoz tetszés sze-40 rinti mennyiségű keményítőt vagy keményítőhidrolizátumot adhatunk, feltéve továbbá, hogy az a készítménynek megfelelő stabilitást biztosít. Egyes esetekben már 2 vegyes % keményítő vagy keményítő-hidrolizátum hozzáadásával is nagy 45 stabilitásfokozódást érhetünk el. A stabilizálószer adott esetben kismennyiségű puffer-adalékanyagot is" tartalmazhat. A pufferek mennyiségét úgy választjuk meg, hogy a stabilizáló közeg pH-értéke a vírus szempontjából optimális 50 (pl. 6,5 és 7,5 közötti) legyen. Ennek megfelelően egy jó hatású stabilizálószer pl. szarvasmarhaalbumin, szacharóz és pufferanyag, pl. alkálifémfoszfát elegyéből áll. A stabilizálószerhez alkálifémglutamátokat is adhatunk, ezek alkalmazása azon-55 ban a sejtmentes víruskészítmények hatásosságának fenntartása és a stabilitás fokozása szempontjából nem feltétlenül szükséges. Az albuminból vagy kazeinból és szacharózból álló stabilizálószer-elegyeken kívül előnyösen alkal-60 mázhatjuk még a következő elegyeket: albumin, szacharóz és alkálifém-glutamátok elegye, kazein, NZ, amin és alkálifém-glutamátok elegye, illetve NZ, amin, szacharóz, alkálifém-foszfátok és alkálifém-glutamátok elegye. A gyakorlatban előnyösen 65 az SPGA jelű stabilizálószer-elegyet használjuk fel 2