166890. lajstromszámú szabadalom • Eljárás FC-126 pulykaherpesvírus és Marek-betegséget okozó JM GA vírus stabil szuszpenziójának és liofilizátumának előállítására

166890 [Bovarnick és mtsai: J. Bact. 59, 509—522 (1950)], amely 7,46 g szacharózt, 0,05 g monokáliumfoszfátot, 0,16 g dikáliumfoszfátot, 0,01 g mononátriumglutamátot és 1,0 g por alakú szarvasmarhaalbumint tartalmaz 100 ml desztillált vízben oldva. Különösen jó eredményeket érünk el, ha 1 súlyrész sejtanyaghoz kb. 10 súlyrósz SPGA stabilizálószert adunk. Az SPGA stabilizálószer nagyobb — pl. 150 súlyrész — mennyiségben is kitűnő eredményeket biztosít. Nyilvánvaló, hogy az SPGA stabilizálószerben a fehérje és a keményítő vagy keményítőhidrolizátum koncentráeióhatérai a fent megadott tartományba esnek. A találmány szerinti eljárás során a továbbiakban szokásos szárítási eljárásokkal, pl. fagyasztással vagy liofilizálással nagymértékben hatásos, száraz, stabilizált víruskészítményeket állíthatunk elő a fenti folyadékokból. A találmány tehát nemcsak folyékony, vizes sejtmentes víruskészítmények és vakcinák előállítására, hanem száraz, nem vizes termékek előállítására — pl. a fenti folyékony készítmények szárításával kapott termékek gyártására — is vonatkozik. A gyakorlatban a termékeket a találmány szerint aszeptikus körülmények között dolgozzuk fel, és előzetesen bakteriálisán sterilizált komponensekből indulunk ki. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. Amennyiben mást nem közlünk, a példákban feltüntetett %-értékek vegyes %-ot jelentenek. Felhasznált vírustörzsek A találmány szerinti eljárást bemutató példákban kiindulási anyagként háromféle, nagymértékben sejthez kötött herpesvírus-törzset alkalmaztunk. Ezek a vírustörzsek a következők: FC—126 pulykaherpesvírustörzs, Marek-féle megbetegedést okozó JM vírustörzs és Marek-féle megbetegedést okozó GA vírustörzs. a) A Marek-féle megbetegedést okozó JM vírustörzs nagymértékben sejthez kötött, és a pulykaherpesvírussal antigén-kapcsolatban van. A vírustörzs mind a fertőző laryngotracheitis, mind a kacsaenteritis vírusától eltér. Ezt a vírustörzset JM megjelöléssel láttuk el, és az American Type Culture Collection (Washington, D. C.) gyűjteményben ATCC VR 585 szám alatt helyeztük letétbe. A törzset a Cornell University intézet gyűjteményében is letétbe helyeztük, ahol a vírus RT—711 számon beszerezhető. A JM törzs előállítását és jellemzőit Sevoian és mtsai [Vet. Med. 67, 500—501 (1962)] részletesen ismertetik. b) Az PC—126 pulyka-herpesvírus törzs nagymértékben sejthez kötött, és a csirkék Marek-féle megbetegedését okozó vírussal antigén-kapcsolatban van. A szakirodalom szerint ez a törzs 1 napos csirkékbe beoltva Marek-féle megbetegedéssel szemben védőhatást idéz elő. A herpesvírust FC—126 (HVT) megjelöléssel láttuk el, és az American Type Culture Collection (Washington, D. C.) gyűjteményben ATCC VR 584 számon helyeztük letétbe. A vírustörzset a Cornell University intézet gyűjteményében is letétbe helyeztük, ahol a vírus RT— 720 számon beszerezhető. A vírustörzs jellemzőit Witter és mtsai [Am. J. Vet. Res. 31, 525—538 (1970)], valamint Okazaki és mtsai [Avian Dis. 14, 413—429 (1970)] részletesen ismertetik. c) A Marek-féle megbetegedést okozó GA vírus-5 törzs ugyancsak nagymértékben sejthez kötött. A vírustörzset GA megjelöléssel láttuk el, és az American Type Culture Collection (Washington, D. C.) gyűjteményben ATCC VR 624 számon helyeztük letétbe. A vírustörzset a Cornell University 10 intézet gyűjteményében is letétbe helyeztük, ahol a vírus RT—743 számon beszerezhető. A GA törzs előállítását és jellemzőit Edison és mtsai -[Avian Dis. 12, 467—475 (1968)] részletesen ismertetik. 15 1. példa A később ismertetésre kerülő 1—3. kísérletben a fent ismertetett, Marek-féle megbetegedést okozó JM vírustörzset használjuk fel. A Marek-féle megbetegedést okozó JM vírustörzset a vírussal meg-20 fertőzött, frissen leölt csirkék bőréből különítjük el a következő módszer szerint: A bőrdarabkákról eltávolítjuk a felületi tollakat, a bőrdarabkákra grammonként 5 vagy 10 ml, foszfátpufferrel puffe'rolt sóoldatot (pH = 6,8) öntünk, a bőrdarabkákat 25 aprítjuk, majd a szuszpenziót 5 percig Sorvall Omni-Mixer berendezéssel (Ivan Sorvall, Inc., Norwalk, Conn.) homogenizáljuk, ós W 140 D Sonifer Cell Disrupter készülékkel 7-es energiafokozatban (26—32 ma) 2 percig besugározzuk (a készülék 30 gyártója a Heat Systems Ultrasonics Inc. cég, Plain view, Long Island, N. Y.). A szuszpenziót 650 g gyorsuláson végzett centrifugálással derítjük, és a felső folyadékréteget —65 °C-on fagyasztjuk. A kapott készítmény nem tartalmaz életképes 35 sejteket. Az 1—3. kísérletben a vírusszuszpenziókat felengedni hagyjuk, majd a később ismertetésre kerülő módon kezeljük, végül 1 vagy 2 ml-enként ismét fagyasztjuk vagy lifüizáljuk. A 4—8. kísérletben az előzőektől kissé eltérő el-40 járásmódot alkalmazunk. A Marek-betegséget okozó JM és GA törzsek és az FC—126 pulykaherpes-vírustörzsek forrásaiként 50 mm-es Petri-csészékben tenyésztett, nagymértékben (75%-nál súlyosabban) fertőzött tenyészeteket alkalmazunk. A Marek-féle 45 megbetegedést okozó JM és GA vírustörzset csirkevese-sejteken tenyésztjük. A 643. és 659. sz. tenyészetben a pulyka-herpesvírust csirkevese-sejteken, míg a" 654. sz. tenyészetben csirke-embrió-kötőszöveten tenyésztjük. A felső folyadékróteget el-50 öntjük, és az egyes tenyészetekre a 6. kísérletben 2 ml, a 4., 5. és 7. kísérletben 2,5 ml, míg a 8. kísérletben 5 ml szuszpendáló közeget töltünk. Kétféle szuszpendáló közeget használunk fel. A sejtekét kapargatassal szabaddá tesszük, majd a 4. vagy 5. 55 tenyészetből, (illetve a 8. kísérletben kezelésenként egyetlen tenyészetből) gyűjtjük. A szuszpenziókat 2 percig ultrahanggal kezeljük, majd a folyadékot 1 ml-es részletekben —65 °C-on fagyasztjuk vagy liofilizáljuk. 60 Az egyéb tenyészetekből származó sejteket a teljes sejtek eltartására szolgáló módszerek szerint gyűjtjük össze és —65 °C-on fagyasztjuk, dimetilszulfqxid védőanyag jelenlétében. Spencer és mtsai módszerét követjük [Avian Dis. 11, 274—287 65 (1967)]. 3