166733. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3'-helyettesített-2''-OXO-piráno (5'6'-c)- 4-dezoxi-rifamicin- SV előállítására

166733 6 megadott két közlemény szerint kezeljük. Az endogén RNS-igényű DNS-polimeráz aktivitását 0,01% NP—40-nek a tisztított vírusszuszpenzióhoz adagolása után közvetlenül határozzuk meg. A tisztított vírus-polimeráz aktivitását (DNS-polimeráz) nem NP—40, hanem 2 [xg poli-d(A—T)-nek, mint templátnak az adagolása után határozzuk meg. 3. A rifamicin-származékok enzimgátló hatásának vizsgálata A rifamicinszármazékok dimetilszulfoxiddal (DMSO) készült 5 mg/ml-es oldatait 4 C° hőmérsékleten tároljuk. Az endogén RNS-igényű DNS-polimeráz aktivitásának gátlását úgy határozzuk meg, hogy a 15—30 jj.g vírusfehérjét tartalmazó feltárt vírusszuszpenzió adagolása előtt 2 \xl DMSO-dal hígított, a vizsgálandó származékot tartalmazó oldatot adunk a reakcióelegyhez. A kontrollhoz 2 [xl DMSO-ot adunk. Az elegyet 60 percen át 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk. A tisztított enzim aktivitásának gátlását oly módon határozzuk meg, hogy 30 jxl enzimoldatot (1—2 f/.g fehérje) és 2 \xl DMSO-os antibiotikumoldatot, illetve DMSO-ot 10 percen át 37 C° hőmérsékleten előinkubálunk, majd 70 JJII szubsztrátelegyet adunk a reakcióelegyhez, és a fentiekben megadottak szerint folytatjuk az inkubációt. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek a kísérletekben 2—100 pig/ml-es, vagy ennél kisebb koncentrációban 10%-nál kisebb értékre csökkentették a H3

-dTTP beépülését a kontroli-kísérlethez képest, ami világosan jelzi a legújabb biokémiai szemléletnek megfelelő, RNS-tumorvírusok okozta karcinogenezis mechanizmusának gátlását. Az RNS-igényű DNS-polimeráz gátlását egér(murine)-leukémiavírusból származó polimerázzal is kimutattuk. Az egér(murine)-leukémiavírus RNS-igényű DNS-polimerázát Triton X 100-zal roncsolt vírusokból, Gallo és munkatársai közleménye [Nature New Biol., 232, 141 (1971)] szerint különítettük el. Mind a Rauscher-, mind a Moloney-típusú vírusokat egy alacsony fordulatszámmal, a sejttörmelékek eltávolítására végzett centrifugálás és 60—20%-os szacharóz grádiens-centrifugálás után az 1,16 g/ml-es szacharóz-fázisban, tisztítva különítjük el. A tisztítás után kapott készítmény milliliterenként 1011 vírust tartalmaz. Templátként endogén 70 s RNS-et adunk a reakcióelegyhez. Az enzimet a hatóanyagok 50 [i.g/ml-es, vagy kisebb koncentrációban gátolják. Hasonló eredményeket kapunk, ha az emberi eredetű tumorsejtekből elkülönített polimeráz-enzimet használjuk. Ebben az utóbbi esetben a szelektív hatás bizonyítására egészséges sejtekből nyert polimerázzal szemben is megvizsgáltuk a vegyületek hatását. A találmány szerinti eljárással előállított I általános képletű rifamicinszármazékok közül néhánynak a hatását megvizsgáltuk (1) emberi, egészséges (PHA-stimulált) vér-limfocitákból, (2) egészséges donorokból származó limfoblaszt sejtekből és (3) emberi, leukémiás vér-limfoblasztokból nyert két tisztított DNS-polimeráz enzimre. Templátként szintetikus és/vagy természetes eredetű vegyületeket használunk. A kísérleteket a következők szerint végezzük: 1. Az embervérből származó limfobiasztok A leukémiás limfoblasztokat akut limfómás leukémiában (ALL) szenvedő betegek prifériás elhelyezkedésű ereiből nyertük leukoforézissel. A sejteket először mostuk, majd az eritrocitákat hipotóniás lízissel eltávolítottuk. Az egészséges limfocitákat véradó donorok perifériás elhelyezkedésű véredényeiből, a granulocitáknak nylon 5 kromatografáló oszlopon való elkülönítése után kaptuk. Ezeket Gallo és munkatársai [Nature, 228, 927 (1970), Science, 165, 400 (1968)] szerinti eljárással, 72 órán át fitohemagglutinnel (PHA) kezeljük, amikor DNS-polimeráz tartalmuk a lehető legmagasabb értékre emelke-10 dik. A tárolás nehézségei miatt megfelelő mennyiségű sejt elkülönítése nem megoldható, a kevéssé tiszta DNS-polimeráz vizsgálatakor emberi eredetű, egészséges szövettenyészetből (1788) nyert sejtekkel egészítettük ki a vizsgálatokat. A jó eredményeket adó vegyületeket ez-15 után az egészséges és leukémiás donorok véréből nyert limfocitákból kivont tisztított enzimekkel részletesen vizsgáljuk. A szövettenyészeteket az Associated Biomedic Systems, Inc. bocsájtotta rendelkezésünkre. 20 2. DNS-polimeráz elkülönítése A sejtekben található DNS-polimerázokat egészséges vérből elkülönített limfocitákból, leukémiás beteg vérének limfocitáiból és limfoid (1788) sejtekből kaptuk oly módon, hogy hipotóniás pufferben homogenizáltuk, és 25 Triton X 100-zal és/vagy magas sókoncentrációjú oldattal extraháltuk az extralizoszomális üledéket. A sejtextraktumot differenciál-centrifugálás után DEAE-cellulóz, foszfocellulóz és Sephadex G 200 oszlopon kromatografálva tovább tisztítjuk. 30 3. A DNS-polimeráz mérése A DNS-polimeráz aktivitásának meghatározását 100 fii végtérfogatú reakcióelegyben végezzük. A reakcióelegy 50 mM (pH 8,3) trisz-HCl puffert, 6,0 mM magnéziumacetátot, 8,0 mM ditiotreitolt és 6,0 mM nát-35 riumkloridot tartalmaz. A DMSO-ban oldott gátlószer adagolása után a reakcióelegy pH-ját az eredeti értékre állítjuk vissza. DMSO végkoncentrációja a reakcióelegyben és minden kontroli-mintában 0,5%. A méréshez az enzim kon-40 centrációját úgy választjuk meg, hogy az óránként körülbelül 1,0 pM mennyiségű termék beépülését katalizálja. Az enzimet a legtöbb esetben a gátló hatású vegyülettel 5 percen át előinkubáljuk. Az előinkubáció után vagy szintetikus dezoxiribonukleinsav (poli-d(A-T) 45 (Miles Lab.) és DNS—RNS-hibrid (oligo-dT—poli-rA), 5 [xg/ml-es mennyiségével vagy természetes eredetű templát adagolásával, például a lazac spermájából kivont DNS-val (50 (Jig/ml) és endogén 70 s vírus-RNS-val indítjuk el a reakciót; a reakcióelegy 10 |i,Ci(H3-metil)-50 -TPP-ot (New England Nuclear, 18,6 mC%M, használat előtt liofilizáljuk és 0,01 mólos sósavban oldjuk) és dATP-ot (8—10-5 M, szintetikus templáttal), vagy mind a három dezoxinukleozidtrifoszfátot (8—10-5

M, RNS-val vagy DNS-val kiegészített) is tartalmaz. 55 Egyes kísérletekben az enzimet nem vetettük alá a gátlóanyaggal kivitelezett előinkubációnak. Ebben az esetben a reakciót úgy indítjuk, hogy a gátlószert is tartalmazó reakcióelegyhez adjuk az enzimet. Az inkubáció kezdetén és az inkubáció kezdetétől számított 30. 60 percben mintát veszünk, a mintákhoz 2 ml 0,08 mólos nátriumpirofoszfátot adunk, majd hideg, 12,5%-os triklórecetsav (TCA) és gomba-RNS (400 fi,g) adagolásával leállítjuk a reakciót. A kivált csapadékot Millipore-szűrővel elkülönítjük, 5%-os TCA-val alaposan mossuk, 65 a mosást DMSO, etanol és 0,1 mólos nátriumklorid 3