166733. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3'-helyettesített-2''-OXO-piráno (5'6'-c)- 4-dezoxi-rifamicin- SV előállítására
7 166733 8 0,5 : 70: 29,5 arányú elegyének 1 ml-ével megismételjük, a terméket szárítjuk és radioaktivitását Packard folyadék-szcintillációs számlálóval meghatározzuk. Szintetikus úton előállított DNS-templátot használva, a leukémiás sejtek polimeráz-enzimjének 50%-os gátlását 5—20 [j.g/ml-es hatóanyagkoncentráció mellett figyeltük meg. ; Ha a reakciót szintetikus úton előállított RNS-templáttal (poli-rA-rU) végezzük, úgy az még érzékenyebb. A természetes forrásból származó templáttal egészséges sejtekkel és tumprsejtekkel végzett kísérletekben a tumorsejtekből származó enzimek még érzékenyebbnek mutatkoznak a találmány szerinti eljárással előállított vegyületekkel szemben. A találmány szerinti eljárással előállított új rifamicinszármazékok egyéb biológiai szempontból értékes tulajdonságai, hogy egerekben, patkányokban és az emberi sejtekben gátolják a murine(egér)-szarkomavírus Moloney- és Kirsten-féle törzsei által indukált „fókusz"-ok kialakulását; a már fertőzött egér és emberi sejtekben a vírusok keletkezését szelektíve gátolják; hatnak az eredeti állapotukba visszatérő, egér(murine)-szarkomavírust szabaddá nem tevő egér- és patkánysejtekre. A találmány szerinti eljárással előállított rifamicinszárrnazékok fentieken kívül, a kolónia-képzési képesség meghatározására végzett kísérletek szerint az egerekből, patkányokból és az emberből származó, vírusok által megtámadott és átalakult sejtekre szelektíve toxikus hatásúak. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületeknek a Moloney-féle szarkomavírus okozta fókuszképzésre kifejtett gátló hatásának vizsgálatára BALB/3T3 szövettenyészettel a következő kísérleteket végezzük el: BALB/3T3 sejtkultúrát tenyésztünk 250 ml-es műanyag lombikban 10% marhaszérumot tartalmazó Eagle-féle minimális táptalajon. A sejteket tripszines sóoldatban szuszpendáljuk, a sejtek számát Coulter-számlálóval meghatározzuk és táptalajjal hígítjuk a tenyészetet. Tumor-homogenizátumként Moloney egér(murine)-szarkomavírust használunk. A vírusokat Swiss-féle egérembrió-sejttenyészetben négyszer passzáljuk, majd a BALB/3T3 sejttenyészetet használva meghatározzuk a fókusz-képzési képességet. A kísérleteket Hartley és Rowe [Proc. Nat. Acad. Sei., 55, 780 (1966)] általjavasolt módosításokkal végeztük. A lombikokat steril, 25 ml térfogatú táptalajjal töltjük és 1—2 X 106 sejttel oltjuk, a tenyészetet 24 órán át 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk. A táptalaj eltávolítása után, 0,5 ml táptalajban, előre meghatározott számú fókusz-képző részecskét tartalmazó vírusszuszpenziót juttatunk az egyrétegű sejttenyészetre, 90 percen át 37 C° hőmérsékleten végzett inkubáció után az adszorpció teljes. Az adszorpciós szakaszt követően előre meghatáorzott mennyiségű, általában 5—10 [xg/ml, dimetilszulfoxidban oldott (1 mg/ ml) pirönrifamieinszármazékot és 25 ml táptalajt (a hatóanyaggal együtt) adunk a tenyészethez, majd folytatjuk az inkubációt. Egy tenyészethez, kontrollként, csak dimetilszulfoxidot és táptalajt adunk. Három napon át tartó inkubáció után friss táptalajt adunk a tenyészethez, majd a hetedik napon meghatározzuk az átalakult sejtek számát (fókuszok). A fenti kísérleteket a New Jersey szerotípusba tartozó vezikuláris sztomatitisz-vírussal megismételjük. A kísérleteket, a növesztést és a vírusok számának meghatározását ez esetben Hackett és munkatársai által javasolt [Virology, 31, 114 (1967)] módszerrel végeztük. A fenti kísérletekből világosan kiderül, hogy a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek a vírusok által az állati szervezetben indukált tumorokat hatásosan gátolják. 5 A következőkben a találmány szerinti eljárást példákkal szemléltetjük. Az előállított vegyületeket önkényesen megválasztott szabályok szerint nevezzük élés az atomokat önkényes szabályok szerint számozzuk. így a 2-piron-gyűrű 4- és 3-helyzetű atomokon keresztül kapcsoló lódik a 4-dezoxirifamicin SV-hez. A vesszővel jelölt számok a piron-gyűrűhöz, a vessző nélküli számok a rifamicin-részhez viszonyított helyzetet adják meg. 15 1. példa A 3'-acetil-2'-oxo-piráno[5',6'-c]-4-dezoxi-rifamicin SV előállítása 70 ml tetrahidrofuránban 2 mM 3-formil-rifamicin 20 SV-t oldunk, az oldathoz 1 ml piperidint és 2 mM acetecetsav-etilésztert adunk. 30 percen át forraljuk a reakcióelegyet, ez idő alatt lejátszódik a reakció. Ezt követően bepároljuk a reakcióelegyet, a száraz desztillációs maradékhoz etilacetátot adunk, az oldat pH-ját szer-25 vétlen savval 2-re állítjuk be. A szerves oldószeres fázist elkülönítjük és háromszoros térfogatú vízzel extraháljuk. Az elkülönített vizes fázist etilacetáttal extraháljuk, az etilacetátos oldatot elkülönítjük, vízmentesítjük és bepároljuk. A száraz desztillációs maradékként kapott 30 nyersterméket acetonbol kikristályosítjuk. Az így előállított termék olvadáspontja 175—183 C°. Kitermelés: 50%. Elemanalízis a C42 H 49 NÖ 11 összegképletre: számított: C: 63,71, H: 6,24, N: 1,77%, 35 mért: C: 60,72, H: 6,32, N: 1,36%. A termék ultraibolya spektruma: Amaxl% 525 346 311 Elcm 82,7 295,1 233,1 2. példa A 3'-karboxi-2'-oxo-piráno[5',6'-c]-4-dezoxi-rifamicin-SV előállítása 45 70 ml kloroformban 2 mM 3-formil-rifamicin-SV-t oldunk, az oldathoz 2 ml piperidint és 2 mM maionsavat adunk. 4 órán át visszacsepegő hűtő alatt melegítjük a reakcióelegyet, ezen idő alatt a reakció lejátszódik. Ezután bepároljuk a reakcióelegyet, a száraz desztillációs 50 maradékhoz etilacetátot adunk, az oldat pH-ját szervetlen savval 2-re állítjuk be. A szerves oldószeres extraktumot térfogata háromszorosának megfelelő mennyiségű vízzel extraháljuk. A vizes fázist elkülönítés után etilacetáttal extraháljuk, a szerves oldószeres oldatot víz-55 mentesítés után bepároljuk. A száraz desztillációs maradékként kapott nyersterméket acetonbol kikristályosítjuk. Az így előállított termék olvadáspontja 191— 202 C°. Kitermelés: 40%. 60 Elemanalízis a C41 H 47 N0 15 összegképletre: számított: C: 62,03, H: 5,97, N: 1,76%, mért: C: 61,69, H: 5,68, N: 1,41%. A termék ultraibolya spektruma: ^maxi% 475 333 307 65 Elcm 116,7 328 269,2 4
