166733. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3'-helyettesített-2''-OXO-piráno (5'6'-c)- 4-dezoxi-rifamicin- SV előállítására

3 166733 4 A kísérletek szerint az 1. és 2. példában ismertetett eljárással előállított vegyületek 0,1—5 gamma/ml-es koncentrációban gátolják a Streptococcus hemolyticus, a Staphylococcus aureus, a Diplococcus pneumoniae és a Mycobacterium tuberculosis H37 Rv növekedését. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek egy másik igen előnyös tulajdonsága, hogy kis koncentrációban gátolják az ismert és széleskörűen használt antibiotikumokra rezisztens mikroorganizmusok növekedését is. A találmány szerinti eljárás egy másik előnye, hogy az előállított vegyületek kémiailag állandóak, ugyanis az oxidálószerekkel könnyen reakcióba lépő hidrokinon-gyűrű nincs jelen a molekulában. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek igen fontos tulajdonsága, hogy az emberi vér leukémiás limfoblasztjaiban jelenlévő dezoxiribonukleinsav-polimerázt és az egészséges sejtekben nem jelenlévő, vírusokra jellemző nukleotidil-transzferázt (polimerázok) gátolják. A legfontosabb víruscsoportok tanulmányozása alapján ismert tény, hogy ezek vagy magukkal visznek a gazdasejtbe, vagy indukálnak abban bizonyos, a replikációjukhoz nélkülözhetetlen polimerázokat. Vannak vírusok, például a pikornavírusok vagy a poliovírusok, amelyek RNS-igényű (dependens) RNS-polimerázt indukálnak a gazdasejtben, míg más csoportok tagjainak, például a leukémia-szarkoma vírusok replikációja RNS-igényű (dependens) DNS-polimeráz jelenlétéhez kötött. Az RNS-igényű (dependens) DNS-polimeráz (ellenkező irányban működő transzkriptáz) jelenlétét és az RNS-vírusokban betöltött igen fontos szerepét Baltimore [Nature, 226,1209 (1970)] és Temin és munkatársai [Nature, 226, 1211 (1970)] ismerték fel. Az RNS-igényű DNS-polimeráz enzim jelenlétét az egyes állatfajok RNS-tumorvírusaiban más kutatók is kimutatták; ezen szerzők és közlemények a következők: Green és munkatársai: Mechanism of carcinogenesis by RNA tumor viruses. An RNA-dependent DNA-polimerase in murine sarcoma viruses; Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 67, 385—393 (1970). Spiegelman és munkatársai: Characterization of the products of RNA direct DNA-polimerases in oncogenic RNA viruses; Nature, London, 227, 563 (1970). Hatanoka és munkatársai: DNA polimerase activity associated with RNA tumor viruses; Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 67, 143 (1970). Scolnick és munkatársai: DNA synthesis by RNA containing tumor viruses; Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 67, 1043 (1970). Az RNS-vírusok szerepére egyes tumorok kialakulásában utal az a tény, hogy az RNS-igényű DNS-polimeráz jelenléte kimutatható az olyan anyák anyatejében, akiknek családjában több esetben előfordult emlőrák, továbbá az utódokban is [Scholn és munkatársai, Nature, 231, 97 (1971)]. Priori és munkatársai [Nature New Biology, 232, 16 (1971)] limfomás gyermek pleurális folyadékából RNS-igényű DNS-polimerázt tartalmazó, ESP-l-nek elnevezett vírust különített el, és a vírust szövettenyészetben sikeresen szaporította. Az egér emlőtumorjában jelenlévő vírus RNS-ához hasonló RNS-at mutattak ki az emberi emlő rákos sejtjeiben Axel és munkatársai [Nature, 235, 32 (1972)]; a hasonlóságot molekuláris szinten végzett hibridizációs kísérletekkel bizonyították. Az emberi emlőrák vírusának létezését az anyatej elektronmikroszkópos vizsgálatával is alátámasztották [Sarker és munkatársai: Nature, 236, 103 (1972)]. Az ember rhabdomioszarkomás sejtjeiben szintén sikerült kimutatni az RNS-igényű DNS-polimerázt, továbbá vírusokhoz hasonló részecs-5 kéket is megfigyeltek [McAllister és munkatársai: Nature New Biol., 235, 3 (1972)]. Jelenleg nem rendelkezünk olyan hatékony gyógyszerekkel, amelyekkel a vírusok okozta megbetegedéseket gyógyítani tudnánk; ennek legfőbb oka, hogy a ví-10 rusok és sejtek anyagcseréje és anyagcsereútjai azonosak. A legreményteljesebb kutatási iránynak olyan vegyületek keresése látszik, amelyek a vírus vagy a vírus jelenléte miatt átalakult sejtek polimeráz-enzimeit gátolják, de nem hatnak a vírus genetikai információnak 15 kifejezésre jutását szabályozó gazdasejt-polimerázokra. A vírus vagy a vírus általakította sejtek enzimjeinek fajlagos gátlóanyagai, különösen az RNS-tumorvírusok polimerázainak gátlóanyagai jelentős szerepet játszhatnak a leukémia és más rákos megbetegedések gyógyítá-20 sara alkalmas vegyületek kutatásában. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek gátló hatását az egér (murine)-szarkomavírus (endogén) RNS-igényű DNS-polimerázára és a tisztított DNS-igényű DNS-polimerázára [poli-d(A—T)templát] meg-25 vizsgáltuk. A kísérleteket Gurgo és munkatársai által [Nature New Biol., 229, 111 (1971)] kidolgozott módszerrel végeztük. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek különböző mennyiségeinek hatását a polimerázra radioaktívan jelzett H3dTTP (timin-dezoxi-30 ribóztrifoszfát) segítségével határoztuk meg oly módon, hogy mértük az oldhatatlan frakciók radioaktivitását. A kísérleteket a következők szerint végezzük: 1. A vírusok elkülönítése és a vírus-polimeráz tisztítása 35 Vírusok által megtámadott patkánysejtekből és egérsejtekből az előzőekben leírtak szerint [Green és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 67, 385—393 (1970); Rokutanda és munkatársai, Nature, 227, 1026—-1028 (1970)] egér(murine)-szarkoma vírusokat különítünk el 40 (Moloney-, illetve Harvey-izolátum). A vírus-polimerázt a tisztított vírusszuszpenziónak 0,5% NP—40-et (nonited P—40), 0,1 M nátriumkloridot, 0,01 M (pH 7,6) trisz-puffert és 0,001 M EDTA-ot (etiléndiamintetraacetát) tartalmazó oldatban, szobahő-45 mérsékleten, 5 percen át való inkubációjával tisztítjuk. Ezután az oldatot 10 mM nátriumfoszfát puffert (pH 7,4), 2 mM magnéziumkloridot, 10 mM ditiotreitolt és 5% glicerint, továbbá 15—30% szacharózt tartalmazó oldatban grádiens-centrifugálással (24 órán át, 38 000 50 percenkénti fordulat, Spinco SW 41 rotor) frakcionáljuk. A 22 frakció közül a legtöbb enzimet tartalmazó 13—17. frakciókat összeöntjük és —70 C° hőmérsékleten 30%-os glicerinben tároljuk. 2. A DNS-polimeráz aktivitásának mérése 55 Az enzimet 1 órán át 37 C° hőmérsékleten 100 jxl reakcióelegyben inkubáljuk. A reakcióelegy 40 mM trisz-puffert (pH 8,0), 5 mM ditiotreitolt, 30 mM nátriumkloridot, 2,5 mM magnéziumkloridot, 0,1 mM dATP-ot, dGTP-ot, dCTP-ot és 10 (ACÍ H3

—dTTP-ot 60 (12—18 Ci/mM) tartalmaz [a reakcióelegyet Green és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 67, 385—393 (1970) szerint állítottuk össze]. A reakciót 150 \ú perklórsav adagolásával állítjuk le. Hordozóként (carrier) borjutimusz dezoxiribonukleinsavat (100 gamma) adunk 65 a reakcióelegyhez; a radioaktív DNS-terméket a fent 2