166686. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, hipokalcémiás hatású dotriakontapeptidamidok előállítására
55 166686 56 5. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOQ-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 440 mg, az 1. példa 43. pontjában leírt dokozapeptidamidot az 1. példa 62. pontjában leírt módszerhez hasonlóan BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu -Gly-OH vegyülettel kondenzálunk. A termék szilikagéles vékonyrétegkromatogramon Rf5=0,29 értéket mutat. 3. példa i I H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Leu-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 . acetát (Leu8 -kalcitonin M. acetát) 200 mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-1 Cys-Leu-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp (OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 vegyületet adunk 3,5 ml jéghideg, 95%-os trifluorecetsavhoz, az elegyet a peptidszármazék teljes oldódásáig melegítjük 30°-on és az oldatot egy órán át állni hagyjuk. Ezután 200 ml jéghideg éterre öntjük. A finom csapadékot leszívatjuk, vákuumban nátriumhidroxid felett szárítjuk, híg ecetsavban oldjuk, és a trifluoracetát-ionok eltávolítására gyengén bázisos Merck No. II ioncserélőgyanta oszlopon szűrjük. Az eluatumot liofilizáljuk. így nyerjük a Leu8-kalcitonin M ecetsavas sóját. Kitermelés: 65%. Vékonyrétegkromatográfia (alumíniumoxid) : Rf52 = 0,48 és R ra = 0,67 (cellulózon): Rf4S = 0,59 A kiindulási anyagot a következőképpen állíthatjuk elő: 400 mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)"1 -Cys-Leu-Leu-Gly-OH vegyületet, 600 mg H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC) -Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 vegyületet, 100 mg N-hidroxiszukcinimidet, 120 mg diciklohexilkarbodiimidet és 6 ml dimetilformamidot 3 órán át 45°-on keverünk. Ezután az elegyet 300 ml éterbe öntjük, és a csapadékot leszűrjük. A nyers terméket metanol-puffer-kloroform-széntetraklorid 11:3:6:7 rendszerben (puffer azonos az 1. példában alkalmazottal) végzett ellenáramú megoszlatással tisztítjuk; K = 0,7. A kiindulási anyagként használt dekapeptidet az 1 287 601 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásban a megfelelő Met8 -dekapeptid előállításánál leírtak szerint állítjuk elő. H-Leu-Gly-OMe vegyületből indulunk ki, ezt Z-Leu-N-hidroxiszukcinimidészterrel reagáltatjuk, a keletkezett Z-Leu-Leu-Gly-OMe vegyületet hidrogénezzük, a H-Leu-Leu-Gly-OMe hidrokloridot TRI-Cys(TRI)-OH vegyülettel kondenzáljuk, az említett szabadalmi leírás 1. példájának 9. pontja szerint, és a keletkezett tetrapeptidszármazékkal úgy járunk el, ahogy az az említett leírásban a 10—18. pontokban van leírva. 4. példa H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Nva-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 . acetát (Nva8-kalcitonin M. acetát) 5 mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Nva-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp (OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 vegyületet 0,2 ml 95%-os trifiuorecetsavhoz adunk és 1 órán át állni hagyjuk. Ezután 5 ml étert adunk hozzá, és a keletkezett csapadékot lecentrifugáljuk, kevés éterrel mossuk és szárítjuk. A trifluorecetsavas sóként keletkezett dotriakontapeptidamidot ioncserélőn acetáttá alakíthatjuk át. Vékonykromatogram Rf52 = 0,45 és Rfj9 = 0,67 (alumíniumoxid) és Rf45 = 0,55 (cellulóz). A kiindulási anyagot a következőképpen állíthatjuk elő: 1. Z-Nva-Leu-Gly-OMe 4,3 g Z-L-Nva-2,4,5-triklórfenilésztert (J. Chem. Soc. (c) 1968, 715) és 2,2 g H-Leu-Gly-OMe vegyületet 15 ml dimetilformamiddal egyesítünk, és a reakcióelegyet 48 órán át 35°-on keverjük. Ezután sok kloroformmal hígítjuk, jéggel hűtjük, és háromszor 5%-os jéghideg káliumkarbonátoldattal és háromszor jeges vízzel kirázzuk. A kloroformos oldatot nátriumszulfáttal szárítjuk, majd szárazra pároljuk, végül a maradék dimetilformamidot 0,1 Hgmm nyomáson lepároljuk. A maradékot kloroformban oldjuk, és egy kloroformmal készített szilikagéles oszlopon kromatografáljuk, melyen kloroform-kloroform + metanol (1 : 1) (1—1 litert) lineáris gradienst alkalmazunk elucióra. 100 ml-es frakciókat szedünk, szárazra pároljuk, tisztaságukat szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálattal állapítjuk meg, és a tiszta frakciókat egyesítjük. A termék Rf -értéke toluol-aceton (1 : 1) rendszerben 0,4. 2. H-Nva-Leu-Gly-OMe 1,7 g fenti tripeptidet metanolban oldunk, és intenzív keverés közben 400 mg 10%-os palládiumszén katalizátorjelenlétében hidráljuk. A hidrogénfelvétel megszűnése után a katalizátort leszűrjük, és az eluatumot szárazra pároljuk. Színtelen gyantát kapunk, amely közvetlenül felhasználható a további feldolgozásra. 3. TRI-Cys(TRI)-Nva-Leu-Gly-OMe 2,5 g TRI-Cys(TRI)-OH és 1,1 g fenti H-Nva-Leu-Gly-OMe vegyületet 40 ml acetonitrillel egyesítünk, és keverés közben 1,3 g diciklohexilkarbodiimidet adunk hozzá. 20 órán át 27°-on keverjük, a kivált terméket 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 28
