166650. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lipáz előállítására mikrobiológiai úton

9 Külön 2 napon át 120 C°-on tenyésztettünk Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum-ot hasonló táptalajon, majd 1 liter folyékony tenyészoldatot aszeptikus körülmények között hozzáadtunk az említett fermentor tartalmához, amelyet percenként 20 liter levegővel levegőztettünk, miközben percenként 300 fordulattal kevertük. A tenyésztést 26 C°-on 2 napon át folytattuk. A termék a II. módszerrel mérve 8,3 egység/ml lipáz-aktivitást mutatott. A folyékony tenyészoldatot 400 liter azonos összetételű folyékony tápoldattal és 100 ml szokásos habzásgátló anyaggal együtt aszeptikus körülmények között acélfermentorba adagoltuk, ahol 30 percen át 120 C°-os gőzzel sterilizáltuk, és percenként 400 liter levegővel levegőztettük, miközben percenként 400 fordulatszámmal kevertük, majd 26 C°-on 4 napon keresztül tovább tenyésztettük. A tenyésztés termékét kétszer szűrtük Sharpless-típusú centrifuga segítségével. A szűrlet mennyisége 265 1 volt. A szűrlet lipáz-aktivitása 13,0 egység/ml volt. A szűrletet „jet" kondenzációs eljárással (bepárlási sebesség: 25 l/óra; a termék hőmérséklete: 30 C°) betöményítettük. Ilyen módon 125 liter koncentrált termékoldatot kaptunk (lipáz-aktivitása: 24,0 egység/ml), amelyet azután permetezéssel és szárítással 8,1 kg nyers lipáz-porrá szárítottunk. A por aktivitását a fentebb leírt II. mérési módszerrel 251 egység/g-nek találtuk. 6. példa 20 1 olyan folyékony tápoldatot (pH =5,6), amely 2% disznózsírt, 2% keményítőt, 2% porított és zsírtalanított szójababot, 0,3% ammóniumszulfátot, 0,2% káliumdihidrogénfoszfátot, 0,5% kalciumkarbonátot, 0,1% magnéziumszulfát-heptahidrátot, továbbá 5 ml szokásos habzásgátló anyagot tartalmazott, 30 literes fermentorba mértünk be, majd 30 percen át 120 C°-on gőzzel sterilizáltuk. Ezután csíramentes atmoszférában hozzáadtuk Chromabocterium viscosum var. paralipolyticum 1 liter olyan tenyészoldatát, amelyet előzőleg 26 C°-on 2 napon át hasonló tápoldatban tenyésztettünk. További 4 napon át 26 C°-on tenyésztettük a kultúrát, miközben percenként 20 liter levegővel levegőztettük, és 300 ford/perc sebességgel kevertük. A micéliumot leszűrtük a tenyészoldatról. Ilyen módon 14,8 liter szűrletet kaptunk, amelynek lipáz-aktivitását a II. mérési módszerrel 11,4 egység/ml-nek találtuk. A tenyészet szűrletéhez ezután 490 g maltodextrint adtunk, és forró levegőáramot (belépő hőmérséklet: 120 C°; kilépő hőmérséklet: 70 C°) vezettünk át az oldaton szárítás céljából. Ilyen módon 927 g nyers lipázport kaptunk, amelynek hatóértékét a II. módszerrel 126 egység/g-nak mértük. 7. példa Mindenben a 6. példa szerinti módon jártunk el, azzal a különbséggel, hogy a disznózsírt olívaolajjal helyettesítettük. így 15,6 liter tenyészoldatot kaptunk, amelynek lipáz-aktivitása az I. mérési módszerrel 5,9 egység/ml-nek adódott. Az így kapott tenyészoldat-szűrletet „jet" kondenzációs eljárással 30 C°-on gyorsan betöményítettük 10 25 l/óra bepárlási sebességgel 7,5 1 térfogatra. Az így kapott koncentrált folyadék lipáz-aktivitása 11,0 egység/ml-nek adódott. Ezután a koncentrált folyadékhoz etanolt adtunk 75% alkohol-koncentráció eléréséig. 5 így 495 g nyers lipáz-port kaptunk, melynek aktivitása az I. mérési módszerrel mérve 107 egység/g-nak adódott. 8. példa 10 Az 1. példa szerinti eljárással kapott tenyészoldatszűrlet 80 ml-éhez (lipáz-aktivitás: 11,0 egység/ml a II. mérési módszerrel mérve) 5 C°-on fokozatosan adtunk acetont, amíg a folyadék aceton-koncentrációja el nem 15 érte a 30%-ot. A kivált csapadékot percenként 9000 fordulatszámú centrifugával elkülönítettük. A felülúszó folyadékot a fentihez hasonló eljárásnak vetettük alá, és a csapadékot akkor különítettük el, amikor a folyadék aceton-koncentrációja 60%-ot, ill. 80%-ot ért el. 20 A 30%, 60%, ill. 80% aceton-koncentráció mellett kapott csapadékokat ezután 30%-os, 60%-os, ill. 80%-os vizes aceton-oldattal mostuk, és a mosófolyadékot centrifugával eltávolítottuk. Ezt az eljárást megismételtük, és a mosott csapadékot vákuumban meg-25 szárítottuk. A szárított lipáz-porok lipáz-aktivitását, valamint a hozamokat az alábbi táblázatban adjuk meg. Aceton-koncentráció Lipáz aktivitás Hozam (%) (egység/g) (g) 30 15 1,03 60 60 0,70 80 1530 0,31 9. példa Mindenben az 1. példa szerinti módon jártunk el, azzal a különbséggel, hogy Chromobaeterium viscosum var. paralipolyticum helyett Chromobaeterium viscosum ATCC 6918-at és Chromobaeterium violaceum ATCC 12472-t használtunk. Ilyen módon az alábbi eredményeket kaptuk: Iff A nyers lipáz-por natóértéke Chromobaeterium viscosum ATCC 6918 Chromobaeterium violaceum ATCC 12472 U g 1,5 g 38 egység/g 35 egység/g 60 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás lipáz előállítására mikrobiológiai úton, azzal jellemezve, hogy a FERM—P No. 137 letéti szám alatt letétbe helyezett Chromobaeterium viscosum var. 65 paralipolyticum lipáztermelő baktériumtörzset valamely 5