166551. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimek kinyerésére és tisztítására szintetikus polimerekkel (kopolimerekkel) történő kicsapás révén

166551 állítanak elő újabban, amelyekben az enzimeket kovalens kötéssel kötik különböző kopolimerekhez, amelyek vízben oldhatatlanok. Ezen vízben nem oldódó enzimkészítmények a reakcióelegyből visszanyerhetők (pl. szűréssel, centrifugálással), így az enzimkészítmény többször is felhasználható: [68—763341 számú USA szabadalom; 67—032881 számú brit szabadalom; Nature (London), 189, (1961) 576; Biochem. J.,98, (1966) 420; Nature (London), 215, (1967) 1491; Biochem. J., 115, (1969) 183; Nature (London), 210, (1966) 367.]. Kísérleteinkben különböző összetételű és átlag-molekulasúlyú szintetikus polimert (kopolimert) állítottuk elő és vizsgáltuk enzimmegkötő képességüket. Mivel ma még a legtöbb enzim térbeli szerkezete nem ismert, nem tudunk a fehérje szerkezetének ismeretében az enzim fehérje kötéséhez alkalmas polimer szerkezetet megtervezni. Ezért akrilsav és metakrilsav polimerek szerkezetét változtatva vizsgáltuk, hogy a szerkezeti módosítások hogyan befolyásolják a polimerek enzimmegkötő képességét. A szintetikus polimerekkel szemben azt a követelményt állítottuk fel, hogy az enzim-fehérjéket 4—5 pH érték között kvantitatíve megkössék, úgy, hogy a további feldolgozási lépésekben jó termelési hatásfok-10 15 20 kai a felhasználási területek igényeinek megfelelő minőségű enzimeket állíthassunk elő, továbbá, hogy szükség esetén a nyers enzimekből jó lehetőséget biztosíthassunk az enzimek további tisztítására is. Megfigyelésünk szerint a poliakrilsav 4,5 és 5,0 pH értékeknél igen gyenge enzimmegkötő képességgel rendelkezik. Az enzimmegkötő képességet stirol-akrilsav kopolimerekkel, a stirol tartalom növelésével — bizonyos határok között — növelni tudtuk és az enzim megkötéséhez szükséges pH érték emelkedett (1,2,3 és 4 számú ábrák). A 15% stirolt tartalmazó 20 000 átlagmolekulasúlyú stirol-akrilsav kopolimer az alfa-amilázt, neutrális proteázt, alkalikus proteázt és Streptomyces fradiae proteázt (pronázt) 4,5 illetve 5,0 pH értékeknél 95—100%-os hatásfokkal megkötötte; 5,10, 40% stirol tartalom esetén rosszabb eredményt kaptunk. Az azonos stirol tartalmú, de különböző átlag-molekulasúlyú kopolimerek esetében az alfa-amiláz és neutrális proteáz megkötésében nagy különbséget találtunk mindkét vizsgált pH értéken (4,5 és 5,0), a pronáz megkötésében csak 5,0 pH értéken észleltünk különbséget, míg az alkalikus proteázt mindkét kopolimer közel azonos hatásfokkal kötötte meg. /. táblázat Polimer vegyület Kicsapási pH Bacillus subtilis Szerk. Ms átlag Stirol tart. % Kicsapási pH amiláz neutr. proteáz alk. proteáz Str. fradiae pronáz Ms átlag Stirol tart. % Kicsapási pH kötési % Stirolakrilsav kopolimer Stirolakrilsav kopolimer 20 000 8 000 10 10 5,0 4,5 5,0 4,5 94 100 67 86 96 96 56 83 88 95 89 94 89 100 63 100 Az enzimek kicsapásához mind a négy enzim esetében 0,5 súly/tf% kopolimert használtunk. A brómstirol akrilsav, nitrostirol akrilsav, valamint az akrilsav-akrilnitril kopolimerek mind a négy vizsgált enzimet igen rossz hatásfokkal kötötték meg. Az alfaamiláz, neutrális proteáz és alkaláz megkötésére 4,5 pH 45 értéken az akrilsav-etilstirol kopolimer 5,0 és 4,5 pH értékeken az 5% nitrostirol-10% stirol-85% akrilsav összetételű kopolimer is alkalmasnak bizonyult. Ezen utóbbi két kopolimer a pronázt csak alacsony hatásfokkal kötötte meg. 50 Tekintettel arra, hogy a táblázatban foglalt kopolimerek előállítása jóval bonyolultabb, vízoldékonyságuk lényegesen rosszabb, mint a 15% stirol tartalmú stirolakrilsav kopolimeré, amely mind a négy enzimet jó hatásfokkal kötötte meg, további kísérleteinkben a négy 55 vizsgált enzim megkötésére a 15% stirol tartalmú 20 000 átlag-molekulasúlyú stirol-akrilsav kopolimert használtuk. Az enzimek kicsapásához (II. Táblázat) mind a négy enzim esetében 0,5 súly/tf% kopolimert használtunk. 60 A metakrilsav kopolimerek, polimerek az alkalázt nem kötötték meg, a Streptomyces fradiae pronázt csak a 20 000 átlag-molekulasúlyú polimetakrilsav polimer és. a metakrilsav-metil-metakrilát kopolimer kötötték meg, de igen rossz hatásfokkal. Az alfa-amilázt és neut- 65 ralis proteázt, a metakrilsav-metil-metakrilát kopolimer kivételével 4,5 pH értéken az összes vizsgált metakrilsav kopolimer 80—98%-ban megkötötte. Az összes vizsgált típus esetében 5,0 pH értéken a megkötés gyengébbnek bizonyult, mint 4,5 pH értéknél. A metakrilsav polimerek átlag-molekulasúlyának változtatásával az alfa-amiláz és neutrális proteáz megkötésében különbség mutatkozott. A megkötéshez legjobbnak a 20 000 átlagmolekulasúlyú polimetakrilsav bizonyult. Az enzim-polimer(kopolimer)-komplex feldolgozására a lehetséges ipari felhasználásokat figyelembevéve két utat választottunk. A komplex szerves oldószeres kezelésével polimert (kopolimert) nyomokban tartalmazó, magasabb és alacsonyabb specifikus aktivitású enzim készítményeket állítottunk elő, a fermentlé előkezelésétől (szeparálás, foszfátgélen történő szűrés, előkezelés nélkül történő enzim kicsapás) függően. Másrészt az enzim-polimer(kopolimer)-komplexet különböző összetételű lúgos pufferben, illetve nátrium-hidrogénkarbonát, vagy nátriumkarbonát oldatban feloldva, ezen oldatokból porlasztva szárítással, kisózással, vagy szerves oldószeres kicsapással, illetve frakcionált kicsapással, polimer(kopolimer)-mentes enzimeket állítottunk elő. 2