166424. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szérum-tiroxin mérésére

3 166424 4 útján elkülönül albumin- és globulin-típusú hordozóanyagaitól. A hígított szérumoldatot a gyantára viszik fel. A gyanta megköti a szérumfehérjéket, az aminosavakat, a tiroxint, a jódtirozint, és az egyéb jódvegyületeket, illetve jódot. Az oszlopot egymás után acetát-pufferoldattal, izopropanollal és ecetsavval mossák; ekkor eltávolítják a szérumfehérjéket, a jódtirozint és egyéb jódvegyületeket. A gyantát ezután 50%-os ecetsavoldattal (pH = 2) eluálják, ekkor a T—4-et teljes mértékben leoldják. Annak ellenére, hogy Galton és munkatársai eredetileg kidolgozott oszlopkromatográfiás T—4 meghatározási módszerének igen sokféle változata terjedt el, az eljárások lényegüket tekintve azonosak egymással, azaz valamennyi eljárásban ioncserélő oszlopra hígított vérszérum-mintát visznek fel, majd a nem-kívánt szennyezőanyagokat leoldják az oszlopról. Ezután a mérendő hormont eluálják, az eluátumot összegyűjtik, és a T—4-et jódelemzéssel meghatározzák. A találmány szerinti T—4 meghatározás a kompetitív fehérje-megkötés elvén alapul, amely a telítéses elemzés egy módosított formája. A mérendő T—4 mintát meghatározott mennyiségű, nyomnyi radioaktív izotóppal megjelölt T—4 mintával elegyítjük. Az elegyhez ezután kötőanyagot adunk, amely meghatározott számú molekulát köt meg. Tekintettel arra, hogy a kötőanyag a jelzett és jelzetlen molekulákat nem képes megkülönböztetni egymástól, a molekulák azonos mértékben adszorbeálódhatnak az aktív centrumokon. Tekintettel arra, hogy a jelzett és jelzetlen molekulák egyenletesen oszlanak el az elegyben, a kötőanyag a kétféle típusú molekulát ugyanolyan arányban köti meg, mint amilyen a szabad (adszorbeálatlan) molekulák aránya. A jelzetlen molekulák koncentrációjának növekedésével a jelzett molekulák aránya csökken, vagyis kevesebb jelzett molekula adszorbeálódik a kötőanyagon, és több jelzett molekula marad szabad állapotban. Ha a jelzett molekulák ismert mennyiségű jelzetlen molekula jelenlétében végbemenő adszorpciójának mértékét kalibrációs görbén felvesszük, kvantitatív meghatározási módszert fejleszthetünk ki. A találmány szerinti eljárás megvalósítása során a szabad T—4 adszorbeálásához szekunder kötőanyagként keresztkötésű dextrángél-oszlopot alkalmazunk, míg primer kötőanyagként emberi vérszérumból származó turoxin-megkötő globulint használunk. A meghatározás első részében az oszlop tetején mért mennyiségű szérumot kismennyiségű, radioaktív jóddal jelzett T—4 oldattal elegyítünk. Az oszlop és a T—4-elegy pH-értéke egyaránt 12—13. Ezen a pH-értéken a T—4 szérumfehérjékkel, így albuminnal, albuminszerű anyagokkal és tiroxin-megkötő globulinnal képezett adszorbátumai teljes mértékben disszociálnak. Amíg az elegy átáramlik az oszlopon, a dextrángél megköti a T—4-et. A szérumfehérjéket ezután barbitál-pufferoldattal (pH = 8,6) leoldjuk, egyúttal az oszlop pH-értékét automatikusan a pufferoldat pH-értékére állítjuk. Ezen a pH-értéken a T—4 gyengébben adszorbeálódik az oszlopon, mint a primer kötőanyagon. Az oszlopra ezután barbitál-pufferoldatban oldott primer kötőanyagot viszünk fel. A két kötőanyag között az egyensúly igen gyorsan beáll. A primer kötőanyagot — amely bizonyos mennyiségű T—4-et adszorbeál — ezután leoldjuk. Az oszlop radioaktivitását a primer kötőanyaggal való kezelés előtt és után meghatározzuk, és az oszlop %-os maradék-radioaktivitását egy kalibrációs görbe adataival hasonlítjuk össze. A kalibrációs görbén a %-os maradék-aktivitást a T—4 koncentráció függvényében vesszük fel. A görbéről leolvashatjuk a meghatározandó szérum T—4 5 tartalmát. A találmány azon a felismerésen alapul, hogy a dextrángél-oszlop 9-es pH-értékig igen nagy mértékben köti meg a radioaktív T—4-et. 9 és 11 közötti pH-értéken a radioaktív T—4 igen könnyen leoldódik az oszlopról, 1 o míg 1 I-nél nagyobb pH-értéken az oszlop T—4-megkötő képessége ismét igen nagy. így a dextrángél a T—4-et megköti, a fehérjéket azonban nem, ezzel szemben az anioncserélő gyanták a fehérjéket és a T—4-et egyaránt megkötik. Az anioncserélő gyantákról a fehérjék nem-15 -specifikusan, és csak savas körülmények között távolíthatók el. Az oszlopban felhasznált dextrángélek keresztkötésű anyagok, amelyek változó mennyiségű epiklórhidrint tartalmaznak. Ilyen géleket ismertet pl. a 3 042 667 sz. 20 USA-beli szabadalmi leírás. A gélek duzzasztáskor 1 g száraz gélre számítva 1—5 g vizet vesznek fel. Ezeket a géleket a Pharmacia cég (Uppsala, Svédország) gyártja, és Sephadex néven hozza forgalomba. Az egyes Sephadex-gélek molekulasúlytartománya és szitafinomsága 25 eltér egymástól. A Sephadex G—10 1 g száraz gélre számítva 1 g vizet, a Sephadex G—15 1 g száraz gélre számítva 1,5 g vizet, a Sephadex G—25 1 g száraz gélre számítva 2,5 g vizet, míg a Sephadex G—50 1 g száraz gélre számítva 5 g vizet vesz fel. A felsorolt gélek közül 30 előnyösen a Sephadex G—25 kereskedelmi nevű gélt használjuk fel. Példa 35 A találmány szerinti eljárásban felhasznált dextrángél-oszlopot a következőképpen állítjuk elő: 500 g száraz gélt 2 liter desztillált vízben szuszpendálunk, és a gélt éjszakán át hidratálódni hagyjuk. A finomszemcsés 40 anyagok eltávolítása során a gélt kb. 5 percig 0,1 n nátriumhidroxid-oldatban szuszpendáljuk, a szuszpenziót 15 percig ülepedni hagyjuk, majd a felső folyadékréteget leszívatjuk. Az utóbbi műveletet háromszor megismételjük, végül a kapott gélt 4400 ml 0,1 n nátriumhidr-45 oxid-oldatban szuszpendáljuk. 4 ml így kapott szuszpenziót 6 ml-es műanyag fecskendőtartályba töltünk (átmérő: 13 mm, magasság: 66 mm). Az egyes fecskendőtartályok aljukon zárószerkezettel, pl. eltávolítható kupakkal vannak lezárva. A műanyag tartályok aljában 50 koaxiálisán egy kb. 1,5 mm vastag, detergenssel kezelt, zsugorított polietilén aljlemezt illesztünk. A szuszpenziót a fecskendőtartályba helyezzük, majd a légbuborékok eltávozásáig ülepedni hagyjuk. Ezután a fecskendőtartályba koaxiálisán az első koronggal azonos méretű, 55 detergenssel kezelt, zsugorított polietilén korongot helyezünk, és szoros érintkezésbe hozzuk a géllel. A felső korong fölött kb. 1,5 ml nátriumhidroxid-oldat marad. A fecskendőtartály felső végét polietilén-kupakkal lezárjuk. Ezzel az eljárással kb. 450 mg gélt tartalmazó 60 oszlopot kapunk. A T—4 meghatározását az így előkészített oszlopokon végezzük, a következő módszerrel: 1. Az oszlop felső zárókupakját eltávolítjuk, a felső folyadékréteget dekantálással elkülönítjük, és az oszlo-65 pot függőleges helyzetbe hozzuk. 2