166424. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szérum-tiroxin mérésére

5 166424 6 2. Az oszlop tetejére 0,45 ml 0,1 n nátriumhidroxid-oldatot viszünk fel, amely kb. 0,1 JJLCÍ aktivitású radioaktív T—4-et tartalmaz. A minta y-számlálóval merve percenként 60 000—120 000 jelet ad. 3. Az oszlop tetejére 0,1 ml szérummintát viszünk fel, és a mintát elegyítjük a radioaktív T—4-et tartalmazó oldattal. Ha kalibrációs görbét kívánunk felvenni, szérumminta helyett nem-radioaktív T—4-et viszünk fel az oszlopra. 4. Az oszlop aljának zárókupakját eltávolítjuk, és a radioaktív T—4-gyel elegyített szérumot átáramoltatjuk az oszlopon. 5. Az oszlopon 4 ml 0,075 mólos vizes barbitál-pufferoldattal (pH = 8,6) mossuk. 6. Az oszlop aljának zárókupakját visszahelyezzük, és y-számlálóval meghatározzuk az oszlop radioaktivitását jel/perc egységben. 7. Az oszlop aljának zárókupakját eltávolítjuk, és az oszlopra 0,15% emberi a-globulint tartalmazó, 0,075 mólos barbitál-pufferoldatot viszünk fel. 8. Az oszlopra 4 ml 0,075 mólos barbitál-pufferoldatot (pH = 8,6) viszünk fel, és az elegyet átáramoltatjuk az oszlopon. 9. Az oszlop aljának zárókupakját visszahelyezzük, és ismét meghatározzuk az oszlop radioaktivitását. 10. Kiszámítjuk az oszlop %-os maradék-radioaktivitását, és a %-os maradék-radioaktivitásból meghatározzuk a szérumminta T—4 tartalmát, ismert koncentrációjú T—4 oldatokkal felvett kalibrációs görbe segítségével. A kalibrációs görbét a következőképpen vesszük fel: 5 mg tiroxinban kötött jód/100 ml koncentrációjú standard T—4 oldatot készítünk. Az előzőkben ismertetett műveletsorozat 3. lépésében az oszlop tetejére szérumminta helyett 100 [A1 standard T—4 oldatot (tiroxinban kötött jód-tartalom: 5 ng) viszünk fel, majd végrehajtjuk a 3—9. lépésekben ismertetett műveleteket. Az oszlop %-os maradék-radioaktivitását a következő képlettel számítjuk ki: a 9. lépésben mért radioaktivitás x 100 a 2. lépésben hozzáadott radioaktivitás A fenti műveletet 50 JJ.1, 150 \ú és 200 JAI standard T—4 oldat (tiroxinban kötött jód-tartalom: 2,5 ng, 7,5 ng, illetve 10 ng) felhasználásával megismételjük. Az így kapott, tiroxinban kötött jód-tartalom %-os maradékradioaktivitás értékpárokból kalibrációs görbét szerkesztünk; az abszcisszán a tiroxinban kötött jód-tartalmat, míg az ordinátán a %-os maradék-radioaktivitást tüntetjük fel. A kalibrációs görbét a csatolt rajz 1. ábráján mutatjuk be. E kalibrációs görbe segítségével a %-os maradék-radioaktivitás ismeretében bármilyen minta tiroxinban kötött jód-tartalmát meghatározhatjuk. A fentiekben a találmány szerinti vizsgálati módszer egy speciális megvalósítási módját ismertettük, nyilvánvaló azonban, hogy a meghatározást a találmány oltalmi körén belül egyéb változatokban is végrehajthatjuk. így pl. a géloszlopot kívánt esetben káliumhidroxiddal vagy ammóniumhidroxiddal is lúgosíthatjuk. Az emberi a-5 -globulint, amelyet primer kötőanyagként használtunk, ekvivalens mennyiségű emberi vérszérummal, bovin-szérummal, vagy bovin-y-globulinnal helyettesíthetjük. Pufferoldatként nátriumfoszfáttal vagy trisz-hidroximetil-amino-metánnal pH = 8—10 értékre beállított, 10 0,01—0,2 mólos vizes lúgoldatokat is felhasználhatunk, előnyösen azonban vizes barbitál-pufferoldatot alkalmazunk, az utóbbi pufferoldatban ugyanis az emberi a-globulin, illetve az egyéb kötőanyagok jobban oszlanak el. 15 A találmány szerinti eljárás egy másik változatában az oldatok radioaktivitását határozzuk meg a géloszlopra való felvitel előtt, és az eluálás után. Ekkor a %-os maradék-radioaktivitást a két érték különbségéből kap-20 juk. Előnyösebbnek és megbízhatóbbnak tartjuk azonban azt az eljárásváltozatot, amikor az oszlop radioaktivitását határozzuk meg az eluálás előtt és után. Az ismert oszlopkromatográfiás T—4 elemzések nem 25 azonosak a találmány szerinti meghatározási módszerrel. A találmány szerinti módszer radioaktív nyomjelző felhasználásával végzett telítési elemzés. Az ismert módszerekben a kromatografáló oszlopot csak a szennyező jódvegyületek elkülönítésére használják, majd a jód 30 meghatározását külön lépésben végzik. Egyes esetekben az elkülönítéshez lúgos pH-tartományban működő ioncserélő gyantaoszlopokat alkalmaznak, majd az oszlopról eltávolított oldatban levő T—4 jódtartalmát pl. cérium-arzén reakcióval mérik. A találmány szerinti telí-35 téses elemzési módszer lehetővé teszi a tiroxin közvetlen meghatározását, szemben az ismert módszerekkel, amelyekkel a tiroxint közvetetten, azaz a jódtartalom mérésén keresztül határozzák meg. 40 Szabadalmi igénypontok: 45 1. Eljárás emberi vagy állati eredetű szérum-minta tiroxin-tartalmának meghatározására izotóphígításos módszerrel, amelynek során meghatározott mennyiségű szérum-mintát epiklórhidrin-keresztkötéseket tartalmazó, 1 g száraz gélre vonatkoztatva 1—-5 g víz felvételére 50 képes, 1 I-nél nagyobb pH-értékű közeggel egyensúlyba hozott dextrángél-oszlopra viszünk fel, és a mintát az oszlopba áramoltatjuk, és az oszlopot 1 I-nél kisebb, célszerűen 8 és 10 közötti pH-értékű vizes lúgos pufferoldattal mossuk, azzal jellemezve, hogy a dextrángél-55 oszlopra a szérum-minta felvitele előtt előre meghatározott mennyiségű, radioaktív tiroxint tartalmazó oldatot viszünk fel, és ezt a radioaktív oldatot a szérummintával elegyítjük, ezután az elegyet az oszlopba áramoltatjuk, majd a vizes lúgos pufferoldattal történő mosás után az 60 oszlopot előre meghatározott mennyiségű, önmagában ismert, tiroxint megkötő eluálószerrel, előnyösen emberi a-globulin- vagy bovin-y-globulin-oldattal eluáljuk, és így a tiroxinnak egy, a szérumminta tiroxintartalmától függő részét eltávolítjuk az oszlopról, majd meghatá-65 rozzuk az oszlop által megkötött radioaktív tiroxinnak 3