166407. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fokozottan vízoldékony peptidamidok és azok származékainak előállítására
3 166407 4 lajdonságukat, ha a savamidcsoportot hidrofób szubsztituenssel látjuk el. Hidrofób szubsztituensként használhatjuk az irodalomban eddig nem ismert 2,4,2',4'-tetrametoxi-benzhidril(Tbh)-csoportot vagy más ismert a peptidlánc károsodása nélkül eltávolítható csoportot, például a 4,4'-dimetoxi-benzhidril (Mbh)-csoportot. A találmány szerinti eljárással a vízoldékony peptidamidokat és azok terminális és oldalláncban levő aminoés/vagy karboxil- és/vagy merkapto-funkciós csoportján lehasítható védőcsoporttal védett származékait, az alkotó aminosavak, vagy ezek védett származékai egyenkénti vagy csoportos kapcsolása útján oly módon állítjuk elő, hogy a savamid csoportot tartalmazó peptid-fragmenst vagy ezek védett származékát valamely hidrofób szubsztituens bevitelére alkalmas vegyülettel, előnyösen 2,4,2',4',-tetrametoxi-benzhidril-aminnal reagáltatjuk és az így kapott savamid csoporton hidrofób csoportot tartalmazó peptidamidot a peptid felépítése után kívánt esetben a funkciós csoportokon levő védőcsoportokat vagy ezek egy részét, kívánt esetben a hidrofób szubsztitúenssel együtt eltávolítjuk. A találmány szerinti eljárásban az aminosavaknak a 2,4,2',4',-tetrametoxi-benzhidril-csoporttal helyettesített amid-származékait olyan módon állítjuk elő, hogy az aminosavnak a megfelelő karboxil-csoportját kapcsoljuk 2,4,2',4'-tetrametoxi-benzhidril-ammnaI valamilyen ismert acilezési eljárás, például a diciklohexil-karbodiimides vagy aktív észteres kondenzáció segítségével. Diciklohexil-karbodiimides kapcsolás esetében előnyösen úgy járunk el, hogy a 2,4,2',4'-tetrametoxi-benzhidril-amin triklórfenol-sóját használjuk a kondenzációban. A 4,4'-dimetoxi-benzhidril-csoporttal helyettesített aminosav-amidok szintézisénél a megfelelő szabad savamid-csoportot reagáltatjuk 4,4'-dimetoxi-benzhidrollal. A találmány szerinti eljárással, védett Asn-savamidcsoportot tartalmazó, tehát BOC-Cys(Acm)-Ser-Asn-(Mbh)-Leu-NHNH2 szerkezetű védett tetrapeptidhidrazidból nyert azidot használva a H-Ser-THr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-OMe hexapeptidészter acilezésére, a megfelelő BOC-Cys(Acm)-Ser-Asn(Mbh)-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-OMe szerkezetű dekapeptidészter 73%-os hozammal állítható elő és a szabad C-terminálisú védett dekapeptid egyszerű metanolos forralással 83%-os kitermeléssel különíthető el tiszta, egységes állapotban. A találmány szerinti eljárás jelentősége igen szembetűnő az aszparagin savamidcsoportjának védése esetén a savamidcsoport mellett még három hidroxiaminosavat is tartalmazó 1—10 védett dekapeptidészter és szabad C terminálisú dekapeptid szintézisénél (46%, illetve 73% és 0%, illetve 83%). A savamidcsoport mellett csupán egy hidroxi-aminosavat tartalmazó 1—4 tetrapeptid-származék esetében a savamid védés előnyös hatása kisebb mértékű. A nem védett és védett Asnrésszel előállított két tetrapeptid származék szintézisét hatékonysági faktorával (Ef ) jellemezhetjük. Az E f értékeket az _ P • n • 100 Ef--~SXs~ képlettel fejezzük ki, ahol a P a tiszta peptid végtermék moláris mennyisége, n a peptid tagszáma, és SAs a szintézisben felhasznált összes aminosav-származék moláris mennyisége. A két tetrapeptid-származék esetében az E f érték 47,4, illetve 52,7. A lazac tirokalcitonin Arg-Thr-^jw-Thr-Gly aminosavsorrendű 24—28 fragmensének szintézisében már 5 számottevő előnyt jelent az Asn-rész védelme: az Asnrész környezetében két hidroxi-aminosav(Thr) található. A Z-Arg(N04 )-Thr-Asn-Thr-Gly-OH szerkezetű peptid-származék szintézisének Ef értéke 21,5. Amikor a szekvenciát védett Asn savamidcsoporttal állítjuk 10 elő a Z-Arg(N02 )-Thr-Asn(Mbh)-Thr-Gly-OH, illetve Z-Arg-Thr-Asn(Mbh)-Thr-Gly-OH szerkezetű peptidszármazék formájában, a szintézisek Ef értéke 43,2, illetve 50,3. A lazac tirokalcitonin irodalmi szintézisében [Gutt-15 mann és mtsai.: Helv. Chim. Acta, 52, 1789 (1969); FARMDOC 88444R] felhasznált köztitermékek hasonlóak a jelen találmányban leírt peptid-származékokhoz. Ez az irodalmi hely nem közöl kitermelési adatokat. A lazac tirokalcitonin C-terminális Ser-Gly-Thr-Pro-20 -NH2 aminosavsorrendű 29—32 fragmensének szintézisénél a terminális amidcsoport védése olyan mértékben szükséges, hogy enélkül a tetrapeptidadim gyakorlatilag elő sem állítható egyszerű tisztítási módszerek alkalmazása mellett. A H-Ser-Gly-Thr-Pro-NH-Mbh. 25 (COOH)2 szerkezetű tetrapeptid-származék védett prolinamidból kiinduló lépésenkénti szintézisének hatékonysági faktora 55,3. A találmány szerinti eljárás a lazac tirokalcitonin fragmensein kívül egyéb vízoldékony peptidamidok, pl. 30 a piroglutamil-hisztidil-prolinamid (Pyr-His-Pro-NH2 ) szerkezetű tireotropint-felszabadító hormon (TRH) szintézisében is előnyösen alkalmazható. A TRH-t A. V. Schally és munkatársai [J. Biol. Chem. 244, AQU (1969)] ismertetik. Előállítására több módszer található 35 az irodalomban. így például a 2 119 966 sz. NSZK-beli nyüvánosságra-hozatali irat szerint a tripeptid szintézisét úgy oldják meg, hogy a hisztidin imidazol-N-atomját tozil-csoporttal szubsztituálják. Bár ilyen módon a hisztidin mellékreakciói kiküszöbölhetők, az eljárás 40 jelentős hátránya az, hogy a védett tripeptid-származékokat csak kromatográfiásan tudják tisztítani. Ezt a hátrányt mutatják az egyéb ismert eljárások, amelyek megegyeznek abban, hogy a köztitermék(ek)-et és/vagy a végterméket oszlopkromatográfiás vagy ellenáramú 45 megosztásos módszerrel kell tisztítani. Az irodalomban közölt kísérleti adatokból kiszámítható a szintézisek hatékonysági faktora (E f ), mely a legjobb megoldásoknál 30, illetve 50 körüli értéknek adódik [K. Inouye és mtsai.: Bull. Chem. Soc. Japan, 44, 1689 (1971), illetve 50 G. Flouret: J. Med. Chem.,73,843 (1970) és FARMDOC 56237S]. A TRH találmány szerinti, tehát hidrofób védőcsoporttal ellátott prolinamidból kiinduló szintázisénél egyrészt elérhetjük a legjobb irodalmi módszereknél talált E f értéket, másrészt szükségtelen a közti-55 termékek és a végtermék oszlopkromatográfiás tisztítása. Ez utóbbi annak köszönhető, hogy a szintézis köztitermékei [H-Pro-NH-Mbh.(COOH)2 , H-His-Pro-NH-Mbh(COOH)a és Z-Pyr-His-Pro-NH-Mbh] kristályos anyagok. 60 A találmány szerinti eljárás legfőbb előnye, hogy lehetővé teszi a fokozottan vízoldékony peptidamidok konvencionális szintézisét, továbbá a szintézis köztitermékeinek egyszerű, vizes extrakción és digeráláson alapu-65 ló tisztítását, miközben azonos vagy nagyobb hozam 2
