166407. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fokozottan vízoldékony peptidamidok és azok származékainak előállítására

5 166407 6 érhető el, mint a megfelelő, nem védett savamidcsoportot tartalmazó peptid-származékoknál. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek előnyösen használhatók fel a tirokalcitonin nevű hormon, valamint a TRH (tireotropint-felszabadító hormon) szintézisében. A tirokalcitonin hormon a vér kalcium szintjét szabályozza, a csontritkulás és az ún. Peget-kór kezelésére használják. A TRH (tireotropint-felszabadító hormon) pedig fontos klinikai diagnosztikum, mely antidepreszszáns hatással is rendelkezik. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. A példákban a hőmérsékleteket C°-ban adjuk meg. AzRf

értékeket szilikagél rétegkromatográfiával határoztuk meg az alábbi oldószerekben: 1. kloroform-n. hexán-ecetsav (8 : 1: 1) 2. kloroform-aceton (7 : 3) 3. etilacetát-piridin-ecetsav-víz (480: 20: 6 : 11) 4. etilacetát-piridin-ecetsav-víz (240: 20: 6 : 11) 5. etilacetát-piridin-ecetsav-víz (120: 20: 6: 11) 6. etilacetát-piridin-ecetsav-víz (60 : 20: 6 : 11) 7. n-butanol-ecetsav-víz (4:1:1) 1. példa BOC-Cys(Acm)-Ser-Asn(Mbh)-Leu-Ser-Thr(Cys-Acm)-Val-Leu-Gly-OH szintézise 1. lépés: Z-Asn(Mbh)-Leu-OMe 2,87 g (11,5 mmól) leucinmetilészter-hidrokloridot feloldunk 35 ml dimetilformamidban, mely 1,28 ml (11,5 mmól) N-metil-morfolint is tartalmaz. Hozzáadunk 6,61 g (10,45 mmól) Z és Mbh-val védett aszparagin-hidroxi-szukcinimidésztert, és egy napon át keverjük. A reakcióelegyet hűtés közben vízzel hígítjuk, a kivált csapadékot szűrjük, vízzel 1 n citromsav-oldattal és ismét vízzel mossuk, majd szárítjuk. A nyersterméket feloldjuk 20 ml meleg dimetilformamidban, és 220 ml metanollal hígítjuk. Hűtés után a kivált anyagot szűrjük, metanollal mossuk és szárítjuk. 5 g (77,3%) cím szerinti védett dipeptidésztert kapunk. Op.: 192— 195°, Rf 0,42—0,56. Karbobenzoxi-aszparagin-2,4,5-triklórfenilészter és leucinmetilészter-hidroklorid piridinben (N-metil-morfolin jelenlétében) végzett kondenzációjánál 83,8% hozammal izolálható a Z-Asn-Leu-OMe (op.: 173—175°, R? 0,77). 2. lépés: H-Asn(Mbh)-Leu-OMe.(COOH)2 5 g (8,07 mmól) védett dipeptidésztert (1. példa, 1. lépés) 76 ml dimetilformamidban szuszpendálunk, majd 1,09 g (12,1 mmól) vízmentes oxálsav és csontszenes palládium hozzáadása után hidrogénezzük. A katalizátort kiszűrjük és az oldatot bepároljuk, majd a maradékot éterrel kristályosítjuk. 4,65 g (100%) dipeptidészter-oxalátot kapunk. Op.: 158—161°; R? 0,45—0,60. A megfelelő H-Ans-Leu-OMe.(COOH)4

94,2% hozammal a fentihez hasonló kísérleti körülmények között állítható elő a nem-védett dipeptidészterből. (Op.: 134—137°; R« 0,35—0,49) 3. lépés: Z-Ser-Asn(Mbh)-Leu-OMe 4,65 g (8,07 mmól) dipeptidészter-oxalátot (1. példa, 2. lépés) feloldunk 12 ml dimetilformamidban, mely 1,8 ml (16,14 mmól) N-metil-morfolint is tartalmaz. Szobahőmérsékleten keverés közben hozzáadunk 4,13 g (8,47 mmól) karbobenzoxi-szerin-pentaklórfenilésztert, majd 5 részletben 30 percenként összesen 0,94 ml (8,47 mmól) N-metil-morfolint. A reakcióelegyet egy napon át keverjük, majd bepároljuk, a maradékot éterrel 5 eldörzsöljük és szűrjük. A csapadékot mossuk 5%-os nátrium-bikarbonát-oldattal, vízzel, 1 n citromsavval, ismét vízzel, s végül éterrel. 4,77 g (83,6%) védett peptidésztert kapunk. Op.: 203—207°; R? 0,8—0,9. A megfelelő Z-Ser-Asn-Leu-OMe a fentihez hasonló 10 módon 73,5% hozammal keletkezik. (Op.: 183—185°, R? 0,47—0,57). 4. lépés: H-Ser-Asn(Mbh)-Leu-OMe.(COOH)4 4,47 g (6,33 mmól) védett tripeptidésztert (1. példa, 3. lépés) és 0,86 g (9,55 mmól) vízmentes oxálsavat fel-15 oldunk 45 ml dimetilformamidban, majd az 1. példa 2. lépésben leírt módon dekarbobenzoxilezzük. 4,08 g (97,2%) tripeptidészter-oxalátot kapunk. Op.: 181— 184°; R? 0,27—0,37. A megfelelő H-Ser-Asn-Leu-OMe.(COOH)2

a fenti-20 hez hasonló módon 95% hozammal keletkezik (op.: 155—157°; R^ 0,10—0,23). 5. lépés: BOC-Cys(Acm)-Ser-Asn(Mbh)-Leu-OMe 4,08 g (6,16 mmól) tripeptidészter-oxalátot (1. példa, 4. lépés) és 1,36 ml (12,32 mmól) N-metil-morfilint 25 feloldunk 15 ml dimetilformamidban, és keverés közben hozzáadunk 3,5 g (6,48 mmol (BOC és Acm-mel védett cisztein-pentaklórfenilésztert, majd 5 részletben 30 percenként összesen 0,72 ml (6,48 mmól) N-metil-morfolint. A reakcióelegyet egy napon át keverjük, 30 majd bepároljuk, diizopropiléterrel eldörzsöljük, szűrjük, diizopropiléterrel, 5%-os kélium-hidrogénkarbonát-oldattal, vízzel, 1 n citromsav-óldattal és ismét vízzel mossuk. 4,78 g (91,5%) nyersterméket kapunk, melyet feloldunk 48 ml forró metanolban, majd 70 ml 35 meleg vizet adunk az oldathoz. Hűtés után a kivált anyagot szűrjük és a fenti metanol-víz eleggyel mossuk. 4,49 g (86%) védett peptidésztert kapunk. Op.: 175— 178°; R? 0,62—0,75. A megfelelő BOC-Cys(Acm)-Ser-Asn-Leu-OMe a 40 fentihez hasonló kondenzációval készül. A tiszta végterméket szilikagél-oszlopkromatográfia segítségével [kloroform-metanol (8 : 2) elegyben] tudtuk izolálni 82,5%os hozammal (op.: 163—166 °; RJ 0,42—0,57). 6. lépés: BOC-Cys(Acm)-Ser-Asn(Mbh)-Leu-NHNH2 45 4,49 g (5,3 mmól) védett tetrapeptidésztert (1. példa, 5. lépés) feloldunk 10 ml dimetilformamidban, és az oldatot 1,33 ml (26,5 mmól) hidrazin-hidrát hozzáadása után szobahőmérsékleten egy napon át állni hagyjuk. A reakcióelegyet metanol-víz (1: 1) eleggyel hígítjuk, 50 a kivált anyagot szűrjük, a nyersterméket 100 ml metanollal kifőzzük, majd hűtés után szűrjük és vízzel mossuk. 3,9 g (86,9%) védett tetrapeptidhidrazitot kapunk. Op.: 213° (bomlik); R* 0,65—0,75. A megfelelő BOC-Cys(Acm)-Ser-Asn-Leu-NHNH2

a 55 fentihez hasonlóan hidranolízissel készül. A végterméket éteres kicsapással izoláljuk 94,2%-os hozammal (op.: 167° (bomlik); Rf 0,40—0,55). 7. lépés: BOC-Cys(Acm)-Ser-Asn(Mbh)-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-OH 60 3,25 g (3,83 mmól) védett tetrapeptidhidrazidot (1. példa, 6. lépés) feloldunk 23 ml dimetilformamidban, és — 15°-on hozzáadunk 1,33 ml (11,5 mmól) 8,63 n sósavas tetrahidrofuránt, majd 0,715 ml (4,6 mmól) terc-butil-nitritet. A reakcióelegyet 15 percen át kever-65 jük — 10°-on, majd 1,27 ml (11,5 mmól) N-metil-mor-3