166397. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új A-287 jelű antibiotikum előállítására
13 A vegetatív növekedést biztosító táptalaj kezdeti pH-ja (beoltás előtt) közelítőleg 7,2. 72 óra múltán (a fermentáció végén) pH értéke közelítőleg 6,6—7,0. A vegetatív növekedést biztosító táptalajt 250 ml-es rázópalackban oltjuk le és 30 C°-on 72 órán keresztül 250 ford./perc sebességen dolgozó rázógépbe helyezve tenyésztjük. A tenyésztés végén a növekedést szemléltető szilárd anyagok mennyisége 20—30%. 166397 10 14 Összetevő Mennyiség Zabliszt (előfőzött) 60,0 g Élesztő 2,5 g Agar 20,0 g K2 HP0 4 1,0 g Czapek-féle ásványisókeverék 5,0 ml Fermentációs oldható maradék* 5,0 g B) Az A—287 antibiotikumok termelése fermentorban Az előző A) részben ismertetett módon készített vegetatív inokulumból 1,25 litert használunk fel 25 liter steril termelő táptalaj beoltására, amelynek összetétele a következő: Összetevő Mennyiség Szacharóz 10,0 g Szójaliszt 10,0 g Melasz 30,0 g Enzimes kazein -hidrolizátum 4,0 g K2 HP0 4 1,0 g MgS04 1,0 g5 Dow Corving habzásgátlószer 0,2 g Czapek-féle ásványi sókeverék* 5, 0 ml Csapvíz ad 25 liter A* Czapek-féle ásványi sókeverék összetétele a következő : Összetevő Mennyiség KCl MgS04 -7H 2 0 FeS04 • 7 H2 0 Ionmentes víz 100 g 100 g 2 g (2 ml tömény sósavban oldva) 1 liter A táptalaj pH-ja az autoklávban 120 C°-on 1,05—1,4 at (15—20 psi) nyomáson 30 percig végzett sterilizálás után 7,2. A leoltott termelő táptalajt 30 literes fermentorban 30 Cc hőmérsékleten 5 napon át fermentáljuk. A fermentációs közeget steril levegővel, 1 térfogat levegő per térfogat táptalaj per perc sebességű levegőbevezetéssel levegőztetjük és szokványos megoldású, 400 for./perc sebességű keverőkkel keverjük. * ButU-alkohol fermentációból származó BY 500 elnevezésű termék. A Commercial Solvents Corp., Térre Haute, Indiana hozza forgalomba 15 3. példa Az A—287 antibiotikum faktorok izolálása 20 • Az 1. példában leírtak szerint kapott és közelítőleg 25 liter mennyiségű fermentlevet Hyfio Supercel szűrési segédanyag (a Johns—Manville Products Corp. által forgalomba hozott kovaföld) alkalmazásával szűrjük. A szűrlet pH-ját sósavoldattal közelítőleg 6,5 értékre 25 állítjuk be, majd a szűrletet kétszer butil-alkohollal kivonatoljuk. A butil-alkoholos kivonatot vákuumban bepárolva, olajos terméket kapunk. Ezt az olajat nátrium-foszfát kiegyenlítő oldatban (0,1 mólos, pH =7,0) oldjuk és az így kapott oldatot három ízben butil-30 alkohollal kivonatoljuk. A butilalkoholos kivonatot vákuumban szárazra pároljuk, majd a maradékot metilalkoholban oldjuk. Az oldatból éter hozzáadására csapadék alakjában válik ki az antibiotikum keverék. A csapadékot centrifugálással elválasztjuk az oldószertől 35 és vákuumban szárítjuk. Sárgásbarna port kapunk, a kiindulási szűrletre vonatkoztatva közelítőleg 50—65%A os hozammal. Ezt a maradékot Sephadex G—25-víz rendszerrel végrehajtott kromatográfiával tovább tisztítjuk és színtelenítjük. A kromatográfiás tisztítás után 40 az aktív anyagot újból oldjuk metil-alkoholban, az oldatból éterrel kicsapjuk és az elválasztást a fenti módon ismételjük. Végeredményként 3 g mennyiségű A—287 antibiotikum elegyet kapunk. Az A és B faktorokat ellenáramú megosztással vá-45 lasztjuk szét. A művelethez 15 db 500 ml-es választótölcsért használunk, mindkét fázisból 250—250 ml térfogatot alkalmazva és az alsó fázist mozgatva. A felső fázis 3: 2 arányú metil-izobutil-keton-butil-alkohol elegy, az alsó fázis pedig 6,8 pH-jú 0,1 mólos nátrium-50 foszfát kiegyenlítő oldat. Az A-faktor az alsó fázissal megy tovább, míg a B-faktor az első tölcsér felső fázisában marad. E fázis vákuumban végrehajtott bepárlása után 0,1 g B-faktort kapunk. Az A-faktort a kiegyenlítő oldat fázisból butil-alkoholos kivonatolással 55 nyerjük ki. A butil-alkoholos kivonatot vákuumban szárazra pároljuk és a kapott maradékot metil-alkoholban oldjuk. Ezúttal is étert használunk a 2,9 g mennyiségű A-faktor kicsapására. 2. példa Az A—287 antibiotikumokat az 1. példában leírt eljárással állítjuk elő, azonban azzal az eltéréssel, hogy az alábbi összetételű ferde agar táptalajt használjuk: 60 65 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás új antibiotikum A-faktor, amely a) fehérszínű amorf vegyület; b) 220 C° alatt nem olvad; 7
