166397. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új A-287 jelű antibiotikum előállítására

11 166397 12 Az A—287-termelő organizmust kb. 20 C° és kb. 35 C° közötti hőmérsékleten tenyészthetjük. A legnagyobb mennyiségben az A—287 antibiotikumokat 30 C° körüli hőmérsékleten kapjuk. Amint az az aerob, levegőztetett süllyesztett tenyészetekkel dolgozó fermentációs eljárásoknál szokásos, eljárásunkban is steril, csíramentes levegőt vezetünk át a táptalajon. Az organizmus jó növekedése és az A—287 antibiotikumok kedvező termelés érdekében a fermentor tartályban átvezetett levegő mennyiségének meg kell haladnia a 0,1 térfogat levegő per perc térfogat táptalaj értékét. A legkedvezőbb növekedést akkor érjük el, ha 0,6 és 1 tf levegő(perc) tf táptalaj közötti levegő mennyiséggel dolgozunk. A fermentáció ideje alatt az antibiotikumok termelését oly módon követhetjük nyomon, hogy a táptalajból kivett minták antibiotikus aktivitását az adott antibiotikumokra ismerten érzékeny organizmusokkal szemben vizsgáljuk, teszteljük. A találmány szerinti eljárással előállított antibiotikum értékmérésé alkalmas egyik organizmus a Sarcina lutea ATCC 9341. A biológiai értékmérést előnyösen papírkoronggal agarlemezen hajtjuk végre. Általában, akár nagyfermentorokban, akár rázópalackban végezzük a fermentálást, a legnagyobb menynyiségű antibiotikum termelést 2 és 6 nap között érjük el. Rendesen 20 és 96 óra közötti fermentációs időket alkalmazhatunk. A megelőzőekben leírt A—287 antibiotikumokat a fentiekben ismertetett süllyesztett aerob fermentációs viszonyok között történt előállításuk után a fermentléből a fermentációs technikában szokásosan alkalmazott módszerekkel nyerhetjük ki. Az A—287-termelő organizmus fermentációja során termelt antibiotikus aktivitás az antibiotikus aktivitást mutató táptalajban illetve fermentleben jelentkezik. Ennek megfelelően, az A—287 antibiotikumok előállítása során alkalmazott izoláló módszerek célja az antibiotikumok lehető legnagyobb mértékű kinyerése a táptalajból illetve a fermentléből. így például, a micéliumokat és nem oldott szilárd anyagokat szokványos módszerekkel, például szűréssel távolítjuk el a fermentléből, a szűrt fermentléből pedig ugyancsak ismert módszerek, például kivonatolás vagy adszorpció alkalmazásával nyerjük ki az A—287 antibiotikumokat. Az eddig alkalmazott viszonyok között a megelőzőkben leírt és NRRL 5614 jelöléssel megnevezett Actinoplanes törzs túlnyomó mennyiségben jelenlevő faktorként az A-faktort termeli. Általában, a teljes kinyert antibiotikum mennyiségének 95—98%-át az A-faktor teszi ki. A B-faktor mennyisége lényegében az antibiotikus aktivitás fennmaradó részének felel meg. A szűrt fermentlé kivonatolására a rövidszénláncú alkoholok, például a butil-alkohol és a pentil-alkohol a legalkalmasabb oldószerek. Az A—287 antibiotikumok további tisztítására az ismételt kivonatolás és az adszorpció a legalkalmasabb módszerek. Az adszorpcióhoz adszorbensekként előnyösen a Sephadex G—25- vagy G—50-et vagy az alumínium-oxidot alkalmazhatjuk. Az A és B antibiotikum faktorokat jól ismert módszerekkel, például ellenáramú megosztással, preparatív vékonyréteg kromatográfiával vagy oszlop-kromatográfiával választhatjuk el egymástól és különíthetjük el egyedi vegyületekként. Az A és B faktor elválasztására alkalmaztuk például a szilikagélen 4: 1: 1 arányú butil-alkohol-ecetsav-víz oldószereleggyel végrehajtott preparatív vékonyréteg kromatográfiai. Az egyes faktorok kinyerése céljából az eluálást metil-alholollal 5 végeztük. Nagyipari léptékű elválasztáshoz az oszlopkromatográfia módszerét alkalmazhatjuk előnyösen. Az oszlopon végrehajtott kromatográfia során a szétválasztáshoz előnyösen alkalmazhatjuk például a következő adszorbenseket és eluálószereket: 1. alumínium-10 oxid; a B-faktor eluálására metil-alkohol, az A-faktoréra 2% ammóniát tartalmazó metil-alkohol; 2. DEAE cellulóz; a szakaszos eluálásra 5,6 pH-jú 0,001—0,2 mólos nátrium-acetát kiegyenlítő oldat; 3. kationcserélő gyanta (hidrogén ciklusban dolgozó XE—64 típus); az eluálásra 15 0,05 mólos citrát kiegyenlítő oldat 5,2 és 5,8 közötti pH gradienssel. Az elválasztásra a legelőnyösebb módszer az ellenáramú megosztás. Jó eredményeket érünk el ezzel a módszerrel, ha az egyik fázis poláros, vízzel elegyedő 20 oldószer vagy oldószerelegy, míg a másik fázis kb. 5,0 és kb. 8,5 közötti pH-értékű kiegyenlítő oldat. A legjobb eredményeket olyan oldószer rendszerek alkalmazásával értük el, amelyekben az egyik fázis oldószerelegy, például metil-izobutil-keton-butil-alkohol vagy etil-acetát-25 -etil-alkohol, a másik fázis pedig kiegyenlítő oldat, amelynek pH-ja a kb. 6,8 és kb. 7,0 közötti tartományba esik. A találmány szerinti eljárás kivitelezésének jobb megvilágítása céljából az alábbi példákat ismertetjük. 1. példa A) Az A—287 antibiotikum termelése rázott tenyé-35 szetben Actinoplanes utahensis NRRL 5614 tenyészetet állítunk elő és tartunk fenn az alábbi összetételű ferde agar táptalajon: 40 - . Összetevő Mennyiség Zabliszt (előfőzött) 65 g Agar 20 g .. Ionmentes víz ad 1 liter 45 A ferde táptalajra leoltjuk az Actinoplanes utahensis NRRL 5614 spóráit és 30 C°-on 10—14 napig inkubálunk. A micéliumban pigment termelődik, amelynek színe a narancsszíntől a narancs-barnáig változik. A te-50 nyészet ezen a táptalajon rendesen nem spórázik. A potenciális növekedési gócok számának növelése céljából ezért a micélium lepedéket lapos, éles oltótűvel macerálni kell. A macerált érett tenyészetet steril vízzel fedjük és steril pálcával óvatosan megkaparva micélium szusz-55 penziót állítunk elő. Ezt a szuszpenziót liofilizálással tartósítjuk. Az ily módon előállított ferde tenyészet egyhatodát használjuk fel 50 ml alábbi összetételű vegetatív növekedést biztosító táptalaj leoltására: 60 Összetevő Mennyiség Zabliszt (előfőzött) 20,0 g Tripton 5,0 g Szárított élesztő 2,5 g 65 Ionmentes víz ad 1 liter 6