166363. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a Bu 1975-antibiotikum-keverék és összetevői előállítására
19 166363 20 A találmány szerinti eljárás előnyös kivitelezési változata szerint az I és II képleten bemutatott Cx és C 2 jelű vegyületeket és ezek gyógyászatilag elfogadott savaddíciós sóit állítjuk elő. Ezen belül legelőnyösebb tulajdonságokkal a C-L és Ca jelű antibiotikumok mono- és diszulfátjai, vizet nem, illetve egy és több vízmolekulát tartalmazó alakjai rendelkeznek. A szabadalmi leírás egészében „gyógyszerészeti szempontból elfogadható savaddíciós sók" alatt Cj vagy C2 jelű vegyület és 1—4 molekula gyógyászati szempontból elfogadható sav kölcsönhatása révén keletkező egyszeres, kétszeres, háromszoros vagy négyszeres addíciós sókat értünk. Ilyen sav például az ecetsav, sósav, kénsav, maleinsav, foszforsav, salétromsav, hidrogénbromid, aszkorbinsav, almasav és citromsav és azok, amelyeket az aminocsoportot tartalmazó gyógyszerek sóinak előállítására általánosan használunk. Az Amberlite IRC—50 egy karbonsav-polimetakrilát típusú, gyengén savas kationcserélő gyanta neve. Az Amberlite CG—50 egy karbonsav-polimetakrilát típusú, gyengén savas, kromatográfiás minőségű kationcserélő gyanta neve. A találmány szerinti eljárást a következőkben példákkal szemléltetjük. A példák a találmány oltalmi körét nem érintik, csupán szemléltető jellegűek. 1. példa milliliter 0,ln vizes ammóniumhidroxiddal, majd 700 milliliter 0,25 n vizes ammóniumhidroxiddal mossuk az oszlopot, majd az antibiotikumot 0,5n vizes ammóniumhidroxiddal eluáljuk. Az eluátumot szakaszosan gyűjtjük össze és az egyes eluátumokat biológiai értékméréssel ninhidrin-reakcióval és vékonyrétegkromatográfiával vizsgáljuk. A biológiailag hatásos vegyületek A2 , Aj, C 2 , QL sorrendben eluálódnak az oszlopról. 9. táblázat A frakció száma Térfogat Vékonyrétegkromatográfia Becsült arány Szilárd halmazállapotú anyag 69—87 88—111 112—159 200 ml 250 ml 500 ml A2 +Ai Ai+Q 4 :6 3 :7 228 mg 193 mg 201 mg A második és harmadik termék ismételt oszlopkromatográfiás tisztítása (CG—50 gyanta, NH4 e -ciklusú) után 120 mg tiszta C2 , illetve 180 mg tiszta C x jelű vegyületet kapunk. 2. példa A C532—B2 szülőtörzsből egyspóra-izolálással kapott Bacillus circulans C532—B2—H48 törzzsel végzünk fermentációt. A rázott tenyészeteket az 1. példában megadott eljárással állítjuk elő. A tenyészetek a maximális antibiotikum-tartalmat az 5. napon érik el (pH 9,3), ekkor Bacillus subtilis PCI 219 tesztorganizmussal szemben mérve 30 mm-es, Klebsiella pneumoniae A20680 tesztorganizmussal szemben mérve 21 mm-es gátlási gyűrűt kapunk. A vizsgálatok szerint a tenyészlé milliliterenként mintegy 150 mikrogramm A és mintegy 100 mikrogramm C jelű vegyületet tartalmaz. 3. példa Bacillus circulans C308—B4 törzset az 1. példában megadott eljárást megismételve rázott lombikban tenyésztünk. A 18 liter térfogatú tenyészlé 75 mg A (Ax + A2 ), 6,4 gramm B és 75 mg C (Q + C 2 ) jelű vegyületet tartalmaz. 4. példa Bacillus circulans C436—Bl törzset az 1. példában megadott eljárást megismételve rázott lombikban tenyésztünk. A 20 liter térfogatú tenyészlé 71 mg A (Ax +A 2 ), 4,1 gramm B és 66 mg C (C x + C 2 ) jelű vegyületet tartalmaz. 5. példa 20 liter térfogatú üvegfermentorokban süllyesztett és levegőztetett fermentációs körülmények között fermentálunk. 10 liter YPG—1 jelű táptalajt, amelynek pH-ját sterilezés után 7,2-re állítjuk be, Bacillus circulans C532— B2—H48 törzzsel oltunk, A tenyésztést 35 C° hőmér-A Bacillus circulans C532—B2 jelű törzs ferdeagaron 30 nőtt tenyészetével 100 ml, 500 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilezett, a következő összetételű YPG-1 jelű táptalajt oltunk: Glükóz 1,5% Polipepton 0,5% 35 Élesztőkivonat 0,2% K2 HP0 4 0,05% MgSO4 .7H 2 O0,05%. A beoltott táptalajt 37 C° hőmérsékleten 24 órán át rázógépen (250 fordulat/perc) inkubáljuk, majd a ki- 40 nőtt tenyészet 2—2 ml-ével 100—100 milliliter következő összetételű fermentációs táptalajt oltunk: Szójaliszt 3% Kukoricakeményítő 2/o CaC03 1% MgS0 4 .7 H 2 0 0,33%. 45 A tenyészet hat napon át 28 C° hőmérsékleten való rázatás után annyi hatóanyagot tartalmaz, hogy 8 mm átmérőjű papírkoronggal, Bacillus subtilis PCI 219 tesztorganizmussal szemben mérve, 25 mm-es, míg Klebsiella pneumoniae A20680 tesztorganizmussal 50 szemben mérve 16 mm-es gátlási gyűrűt ad. Az összeöntött tenyészleveket (200 lombik, 17 liter) szűrjük, a szűrletet a hatóanyag adszorbeálására Amberlite IRC— 50 (NH4®-ciklusú, 500 ml) gyantát tartalmazó oszlopon kromatografáljuk. Vízzel mossuk az oszlopot és ezután 55 a hatóanyagot 2,2 liter In vizes ammóniumhidroxid oldattal eluáljuk. A hatóanyagot tartalmazó eluátumokat összeöntjük, csökkentett nyomáson desztilláljuk, a desztillációs maradékot n-butanollal extraháljuk. A butanolos extraktum desztillációja után desztillációs ma- 60 radékként 1,3 gramm nyers, szilárd halmazállapotú terméket kapunk (B jelű vegyület). A vizes fázist csökkentett nyomáson körülbelül 30 ml térfogatúra töményítjük, a sűrítményt Amberlite CG—50 (NH4 ®-ciklusú) gyantát tartalmazó oszlopon kromatografáljuk. 500 65 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10
