166211. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(halogénfenil- tioacetamido)- CEF-3-EM-4-karbonsav-származékok előállítására

166211 kat olyan tenyészetekből izolálták, amelyeket rosszindulatú daganatos, krónikus csont- vagy az ezekkel összefüggő megbetegedésekben vagy krónikus keringési zavarban, vagy hosszú öntudatlan állapotban, vagy krónikus tüdőfertőzésben szenvedő betegekből tenyésztették ki. A bakteriológusoknak szükségük van olyan módszerekre, amelyek segítségével különválaszthatók a meticillin- rezisztens és a meticillin-érzékeny Staphylococcus aureus törzsek. Jelenleg legkevesebb két ilyen in vitro módszer ismeretes, az egyik különböző hőmérsékleten való inkubáción alapszik, a másik szerint a tenyésztő táptalajba különböző mennyiségű nátriumkloridot teszünk, amikor a Staphylococcus aureus meticülin-rezisztens sejtjei elkülöníthetők az érzékenyektől. Ilyen módon a bakteriológusok hatásosan közreműködhetnek a klinikusokkal és segítséget nyújthatnak a meticillift-rezisztens Staphylococcus aureus törzsek meghatározásához és az ezek okozta fertőzések gyógyításához. . A Flynn tulajdonú, 3 333 136 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban halogénfení Íme rkaptometilcefalosporánsavakat ismertetnek, amelyek penicillináz enzimre nem érzékenyek, savakkal szemben ellenállók és Gram-pozitív és több Gram-negatív mikroorganizmus növekedését gátolják. Ugyanakkor fenti szabadalmi leírásban nincs szó a törzsek meghatározásáról és a meticülin-rezisztens Staphylococcus aureus mikroorganizmusok kezelésének módjairól. A leírás ugyancsak nem említi azt, hogy a meticülin-rezisztens Staphylococcus aureus-ok okozta fertőzések kezelésére melyik vegyület használható. Előnyös lenne olyan antibiotikumokat találni, amelyek hatékonyan használhatók a meticülin-rezisztens Staphylococcus aureus mikroorganizmus okozta fertőzések gyógyítására. A találmány a meticillin-rezisztens Staphylococcus aureus mikroorganizmusok okozta fertőzések leküzdésében különösen előnyösen használható monoklór-, poliklór- és klór-fluorfenü- tioacetamido-cefalosporinszármazékokra vonatkozik. A meticülin-rezisztens Staphylococcus növekedése az I általános képletű vegyületekkel hatásosan gátolható. Amellett, hogy a fenti vegyületek a penicillináz enzimmel nem bonthatók, savakkal szemben ellenállók és patogén Gram-pozitív és több Gram-negatív mikroorganizmus növekedését gátolják, úgy találtuk, hogy különböző meticülin-rezisztens Staphylococcus aureus mikroorganizmus ellen hatásos antibiotikumként használhatók. A vegyületeket ismert módon állítjuk elő és gyógyszerészeti szempontból elfogadható kationokkal képzett sóikként (karboxücsoport) adagoljuk. A sóképzésre például nátrium-, káliumlitium-, ammónium- vagy szubsztituált ammóniumionokat, például metilammónium-, etüammóniumionokat használunk, de előállíthatunk vízben kevésbé oldódó sókat például kalcium-, bárium-, prokain, kinin-, ciklohexü- bisz-metilamin- vagy dibenzüetüéndiaminsókat is. A fenti vegyületeket néha bisz-ciklohexüaminsóként különítjük el a reakcióelegyből és üyen alakban használjuk in vivo kísérletekben. A hatóanyagot előnyösen steril vizes, izotóniás só vagy dextrózzal készült oldatként felnőtteknek 4-6 óránként 0,25 és 0,5 g közötti mennyiségben mtramuszkuláris injekcióban adagoljuk. Orális adagoláskor a hatóanyag felszívódik a vérbe, de ilyenkor azt valamivel nagyobb adagokban, 4-6 óránként 0,5—1,0 g-os mennyiségben, tablettákban, zselatin kapszulákban, vagy az ismert módon készített szuszpenziókban adagoljuk. 5 Ügy találtuk, hogy meglepő módon, a fentiekben ismertetett vegyületek legtöbbje (a későbbiekben részletesen ismertetjük ezeket) emberi vérszérum jelenléte nélkül, a szokásos módon kivitelezett agardiffúziós módszerrel vizsgálva, 11 jug/ml-nél 10 kisebb koncentrációban (legkisebb növekedésgátló koncentráció) gátolja a meticülin-rezisztens Staphylococcus aureus növekedését. A vizsgálatok során Bryson és Szybalski 1952-ben ismertetett (Science 116 45-46) módszerét alkalmaztuk. A penicülin-re-15 zisztens Staphylococcus-ok kezelését Godzeski és munkatársai javaslata alapján végeztük (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1969^47-554). A vizsgálatokhoz műanyag Petri-csészéket használunk. Mindegyik csészébe 10 ml agart öntünk, a 20 Petri-csészék egyik felét 5 mm magasra emeljük és az agart Üyen helyzetben hagyjuk megdermedni. Ez az alapréteg tartalmazza az antibiotikumot, a szérumot és/vagy más vizsgálandó anyagokat. A használt Difco Penessay Agar 2% agart tartalmaz. A „szérum-inakti-25 vációs"-vizsgálathoz 4 ml emberi vagy lószérumot használunk. A szérumot a fedőréteghez is adhatjuk, ebben az esetben szérum-gradiens nem jön létre, de a szérumot tartalmazó kétféle Petri-csészékkel kapott végső eredményekben sok antibiotikum vizsgálata 30 után nem tapasztaltunk különbséget. így a szérumot a továbbiakban az alapréteghez adtuk. Miután az alsó, ferde agarréteg megdermedt, a csészéket vízszintes felületre helyezzük és mindegyikbe további 10 ml agart öntünk, és hagyjuk 35 megdermedni. A rezisztens Staphylococcus-okat tartalmazó inokulumot, ismert módon, a sejtek vizes szuszpenziójának ötvenszeres hígításával készítjük el. A hígítást 0 0,25%-os, steril vizzel vagy sóoldattal készült agárral végezzük. A Gram-negatív mikroorganizmusok inokulumát úgy állítjuk elő, hogy egy 16 órás tenyészetet 0,25%-os vizes agárral ötvenszeresre hígítunk. Az inokulumot egyenletes eloszlású baktéri-45 um-szuszpenzió készítése céljából erőteljesen rázzuk. A szélesztéshez 0,05%-os agart használunk, ezt 1 ml-es pipettával juttatjuk a már megdermedt agarrétegre. Kevés gyakorlattal gyorsan, egyenletesen szélesztett tenyészeteket készíthetünk. Az eljárás 50 alapja az agarréteg ferdére készítésében rejlik, ezt minden csészében azonosan és a lehető leggyorsabban kell elkészítenünk. A tenyészeteket 24 órán át 35-37 C° hőmérsékleten inkubáljuk, majd leolvassuk a baktériumokkal 55 benőtt agarfelület (esik) hosszúságát, az eredményeket az egész agarréteg hosszúságának százalékában fejezzük ki és interpolációval meghatározzuk az agarréteg azon a helyén az antibiotikum koncentrációját. Ugy járunk el, hogy egy, a Petri-csészék belső 60 átmérőjének éppen megfelelő, 100 mm-es grafikont készítettünk, amelyben egy mm egy milliliter 1%-os antibiotikum oldatnak felel meg. Több mérés átlagából számoljuk a legkisebb növekedésgátló koncentációt, a rétegen két, hosszan 65 elhelyezkedő baktériumtenyészet hosszúságát olvassuk le, és 2-3 csészét használunk egy-egy méréshez. Mindegyik lemezre nyolc, hosszában elhelyezkedő 2