166145. lajstromszámú szabadalom • Eljárás stabil kataláz enzimkészitmény előállítására
166145 hol elegyet vagy Na-citrát-glicerin és timol elegyét alkalmazzák. A fenti eljárások többsége alkalmas ipari méretekben történő kataláz előállítására is. Hátránya a fenti eljárásoknak, hogy a kristályosításoknál számottevő (10—60%) veszteség áll elő, hátrányuk továbbá, hogy a kloroform-etanolos tisztísások esetén az ipari kivitelezés igen nehézkes, az acetonos frakcionáláson alapuló eljárások robbanásveszélyesek, az etanolos frakcionálással tisztított katalázokat viszont kis mennyiségben egy olyan mukopoliszacharid jellegű komponens szennyezi, amely kolloid tulajdonságainál fogva a kristályos katalázból készült oldat szűréssel történő sterilezését megakadályozza, mert a szűrőréteg pórusait irreverzibilisen eltömi. A találmány célja olyan eljárás kidolgozása kataláz enzimkészítmény előállítására, amely a jó hozam és egyszerű technológia mellett szűréssel sterilizálható és hosszú ideig tárolható, stabil oldat készítését is lehetővé teszi. A találmány alapja az a felismerés, hogy ha az oldószeres kicsapás előtt az oldatban valamely vízoldható kalciumvegyületből csapadékot képezünk, úgy a tisztítási lépések végén a kristályosodás során a steril szűrést zavaró komponens meg etilalkoholos frakcionálás esetén sem jelentkezik. Ez a felismerés azért meglepő, mert a kataláz enzim tisztítására hasonló lépés az irodalomban nem ismeretes. A találmány további alapja az a felismerés, hogy a csapadékképzés után a tisztított kataláz oldatból az enzim az izoelektromos ponton spontán, gyakorlatilag veszteség nélkül kristályosodik ki vizes oldatból. Ez a felismerés azért meglepő, mert a kristályosodási veszteség elkerülésére hasonló eljárás az irodalomban semmilyen enzim előállításánál sem ismeretes. Végül a találmány alapja az a felismerés is, hogy az alkáliföldfém kezeléssel előállított kristályos katalázból készült oldatból etanolos frakcionálás esetén sem történik kiválás még hónapokon keresztül szobahőfokon történő tárolása esetén sem. Ez a felismerés azért meglepő, mert ismeretes olyan eljárás, amelyik éppen alkáliföldfémeket komplexbe vivő vegyülettel éri el a kataláz oldat stabilitását (1 489 707 ljsz. francia szabadalom). A találmány szerint úgy járunk el, hogy valamelyik oldószeres kicsapás előtt az oldathoz valamely vízoldható kalciumvegyületet adunk, és a kalciumot az oldatból kicsapjuk, majd az utolsó oldószeres frakcionálásnál kapott fehérjecsapadékot megszárítjuk, vagy adott esetben vízben, glicerinben vagy ezeket is tartalmazó oldószerelegyben szuszpendáljuk vagy oldjuk. A kataláz az említett oldószerekben a pH és az oldószerarány függvényében oldható, illetve szuszpendálható. A vízoldható kalciumvegyületet 0,05 és 1% közötti, célszerűen 0,05 és 0,5% közötti mennyiségben adjuk az oldathoz. Kicsapószerként széndioxidot, vízoldható karbonátot vagy hidrogénkarbonátot használunk. A találmány értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy a megdarált marhamájat vízzel extraháljuk, a centrifugálással megtisztított és 5—5,2-re állított pH-jú extraktumhoz mintegy fele térfogatú etanolt adunk. A kapott csapadékot pH = 7,5-ön desztillált vízben oldjuk, az oldathoz kis mennyi-5 sógben 0,05—1% vízoldható kalciumsót célszerűen kalciumkloridot adunk, majd csapadékot képezünk. A csapadék eltávolítása után az oldat pH-ját 5—5,2-re állítjuk, és az alkoholos frakcionálási megismételjük. A, nyert csapadékot pH = 7,5-ön 10 desztillált vízben oldjuk, tisztára szűrjük, majd a szűrlet pH-ját telített KH2 P0 4 oldattal 5,7-re állítva a kataláz enzim néhány óra alatt kikristályosodik. Az elkülönített kristályokat célszerűen vízglicerin-alkohol 6:3:1 arányú elegyében, eset-15 leg híg puffer jelenlétében oldjuk. Pufferként például pH = 7,5-ös foszfát- vagy bikarbonatpuffert használhatunk. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a kö-20 vetkezők: 1. Egyszerű, könnyen kivitelezhető eljárást ad nagy tisztaságú kataláz előállítására. 2. A kataláz tisztítását a robbanásveszélyes aceton helyett etanol alkalmazásával is lehetővé teszi. 25 3. Az egyszerű etanolos frakcionálás ellenére lehetővé teszi olyan oldat készítését, amely szűréssel sterilizálható. 4. Gyakorlatilag veszteségmentes kristályosítást tesz lehetővé. 30 5. Stabil, jól tárolható enzimoldat előállítását teszi lehetővé. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal szemléltetjük. 35 1. példa 50 kg zsírtól és kötőszöveti részektől megtisztított friss marhamájat késsel felszeletelünk és húsdarálón megdaráljuk. Hozzáadunk 100 liter desztillált vizet, alapos elkeverés után egy éjjelen ke-40 resztül +5°C-on állni hagyjuk. Másnap ülepítő ingacentrifugán lecentrifugáljuk, a centrifugálás után 110 liter zavaros felülúszót nyerünk. A felülúszó pH-ját 2 mólos ecetsavval 5—5,2 közé állítjuk, majd keverés közben hozzáadunk 55 liter 45 96%-os etilalkoholt. Tíz percig állni hagyjuk, majd ülepítő ingacentrifugán lecentrifugáljuk. 25 liter térfogatú nedves csapadékot nyerünk, amelyet 60 liter desztillált vízben elszuszpendálunk, a szuszpenzió pH-ját 10%-os nátriumhidroxid ol-50 dattal 7,5-re állítjuk és hozzáadunk 1,7 liter — pH = 7,5-re állított — 10%-os kalciumklorid oldatot intenzív keverés közben. Ezt követően azonnal hozzáadunk 0,85 liter nátriumkarbonát oldatot, amelynek a koncentrációja 192 g Na2 C0 3 literen -55 ként, és a pH-t azonnal 7,5-re állítjuk vissza 2 mólos ecetsav oldattal. A képződött csapadókot ülepítő ingacentrifugán lecentrifugáljuk és a kristálytiszta felülúszó pH-ját 2 mólos ecetsavval 5—5,2 közé állítjuk, majd 40 liter 96%-os etilalkoholt 60 adunk hozzá keverés közben. A kicsapódott katalázt ülepítő ingacentrifuga segítségével gyűjtjük össze. Kristályosítás céljából a nyers kataláz csapadékot 1,7 liter desztillált vízben feloldjuk, a pH-t 65 7,5-re állítjuk 10%-os nátriumhidroxid oldattal, és 2
