166040. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és készülék fehérjék frakcionálására keményítőgélen történő elektroforézissel
3 166040 4 A módszer, alkalmassága ellenére, a technikai megoldás nehézkessége miatt széles körben, rutinvizsgálatokra nem terjedt el, a hozzá szükséges berendezés mérete nagy és az egyes kísérletekhez különböző főzési módokkal előállított gélek eltértek egymástól. Végeredményben a reprodukálhatóság nem volt kielégítő. Az irodalomban ismertetett módszerek szerint a megfelelően előhidrolizált burgonyakeményítőt a szükséges összetételű és mennyiségű pufferrel vízfürdőn melegítik, vagy szabad lángon forrásig hevítik, majd vákuum segítségével eltávolítva a levegőbuborékokat, a cellába öntik. A szabad lángon való hevítés azonban helyi túlmelegedéseket okoz, a művelet nehezen végrehajtható és a vákuummal való buborékmentesítés balesetveszélyes. Az eddig ismert elektroforetizáló készülékek számos hátránnyal bírtak. A gélt az elektroforetizáló cellában kellett előállítani, mert más módon való kezelése túlságosan bonyolult volt. Emiatt a cella a gélkészítés és dermesztés időtartama alatt elektroforetizálásra nem volt alkalmazható. A gél-vastagság pontossága a készülék vízszintes beállításának pontosságától is függött. Az eddig ismert készülékekben a beöntött gélt megdermedése után csákolták, ami sok esetben a gél szakadásához vezetett, de ez csak az elektroforézis teljes lefolytatása után derült ki s ebben az esetben a teljes vizsgálatot meg kellett ismételni. A szűrőpapír-áramkulcs segítségével megvalósított villamos érintkezés bizonytalan volt. Nagy feszültséget és vastag minta esetén bensőséges hűtést kellett alkalmazni, az áramütés veszélye nagy mértékben fennállott. A felsorolt hátrányok miatt az elektroforézis bonyolult és munkaigényes művelet volt, amely emiatt tömegesen végzett vizsgálatok — pl. egészségügyi szűrővizsgálatok — lefolytatására nem volt alkalmas. Találmányunk célja, hogy a keményítőgél-elektroforézist alkalmassá tegyük enzimhisztokémiai vizsgálatok kiegészítésére az enzimhisztokémiai úton kimutatott enzimek izozimspektrumának meghatározásával. Ennek érdekében olyan módszert dolgozunk ki, amely lehetővé teszi a nagyszámú sorozatmérés elvégzését a rutinvizsgálatoktól megkövetelt egyszerűséggel, gyorsasággal, reprodukálhatósággal. Célul tűztük ki továbbá, hogy a vizsgálatok mikroméretekben legyenek elvégezhetők, ideértve a felhasználásra kerülő minta mennyiségét, valamint az inkubálásokhoz használt, sok esetben költséges és nehezen beszerezhető komponenseket tartalmazó oldat mennyiségét is. A keményítő főzését túlnyomáson (1,1-1,3 atm) végezzük és légköri nyomásra való lefúvatással távolítjuk el a levegőt a preparátumból, így kiküszöbölhető a nagyfokú bizonytalanság, valamint a vákuumos levegőeltávolításnál a baleseti veszély. Az autokláv lefúvatását követő lezárás a hűlés során az autoklávon belül nyomáscsökkenést eredményez, ami a levegő eltávolítását tökéletessé teszi. A főzés rövidebb ideig tartó magasabb hőmérséklete homogénebb és jól reprodukálható gélt eredményez. Az inkubáló edényt célszerűbb paraffinból önteni, amelyben csak 1-2 cm3 inkubáló oldatot kell alkalmazni. Használat után a paraffin edényt nem kell tisztítani, hanem újabb öntéssel többször 5 is fel lehet használni. A minták tárolására is alkalmasnak találtuk a paraffinba való ágyazást oly módon, hogy a glicerinnel preparált szeleteket mikroszkóp-tárgylemezre fektetjük és ezt körülöntjük paraffinnal. Az így tartósított preparátum 10 fényképezhető is és korlátlan ideig tárolható. A találmány tehát a keményítőgél-elektroforézis metodikájának teljes átalakításán alapul. Ennek során homogén szerkezetű keményítőgélt állítunk 15 elő tökéletesen reprodukálható módon, egyenletes gélvastagsággal és felülettel. A géllemez valamennyi méretének pontosságát vágószerkezet alkalmazásával érjük el. 2o Uj rendszerű futtató edényt dolgoztunk ki, amelynél a minta betáplálását olyan módon valósítjuk meg, hogy egy 20 mm széles gélen négy minta párhuzamos vizsgálata végezhető és a készülékbe egyidejűleg öt gél helyezhető. Dy 25 módon egyidejűleg 20 különböző minta vizsgálata végezhető és mintánként 3—4 különböző alkotó identifikálása lehetséges a gél további szeletelésével. A találmány szerinti eljárás lényege tehát, hogy 30 az öntőmintában kiformázott géltömb határfelületi rétegét, illetve rétegeit levágjuk, majd a tömböt két részre vágjuk és ezek közé a mintát tartalmazó hordozót, előnyösen szűrőpapírt hézagmentesen behelyezzük. Végül paraffinból néhány cm3 tér-35 fogatú inkubáló edényt öntünk, az elektroforetizált géltömböt néhány mm vastag szeletekre vágjuk és a szeleteket inkubáló edénybe, inkubáló oldatba helyezzük. 40 A találmány szerinti készülék lényege, hogy géltömbje állandó keresztmetszetű hasáb, amelyben a futtatás irányára merőleges átvágás és a vágási felületek között hézagmentesen elhelyezett, a vizsgálandó mintát tartalmazó test, előnyösen egy, 45 vagy több rétegű szűrőpapír van. A találmány szerinti eljárás egy példaképpeni foganatosítási módját és a találmány szerinti berendezés egy példaképpeni kiviteli alakját a 50 nemspecifikus észteráz izoenzimjének meghatározására mutatjuk be. Az 1. ábra a találmány szerinti készülék egy egységének távlati képét mutatja. A felső 1 tartályban levő pufferoldatot a 2 55 viszkozaszivacs magába szívja, miáltal áramvezetésre alkalmassá válik. A 2 szivacs érintkezik a 3 géltömbbel, ez pedig a 4 géltömbbel. A tökéletesen síkban levágott 5 felületek pontos érintkezése jó áramátvitelt eredményez. A 4 géltömb 5 60 alsó vágási felületéhez szorul az egy, vagy több rétegből álló 6 szűrőpapír, amely a vizsgálandó mintát tartalmazza. Ehhez alulról csatlakozik a 7 géltömb, amelyben a fehérjék frakcionálása az egyenáram hatására bekövetkezik. A 7 géltömb 65 10 mm mélységig belelóg az alsó 8 puffertartályba, 2
