165888. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a reagens kreatinkináz meghatározásához

5 165888 6 A fenti értékek — különösen az 1, 6, 7, 11, 12, 13 és 14 számú szérumokat összehasonlítva - azt mutatják, hogy tárolt GSH-oldattal jelentős meghatározási hibák lépnek fel, ntíg a találmány szerinti NAC-oldattal csak nagyon kis eltérések jönnek létre, melyek többnyire a meghatározási módszer hibahatárai közé esnek. A találmány szerinti aktiválószernek a GSH-val szembeni fölénye valószínűleg a jobb eltarthatóságból következik. Ezt a nagyobb stabilitást, amely mind oldatban, mind liofilizált formában megnyilvánul, a következő II. táblázat mutatja: II. táblázat NAC GSH Tárolás Oldat Liofüizátum Oldat Liofüizátum időtartama 4°-on 33°-on 4 -on 33° -on Hét mg/ml mg/palack mg/ml mg/palack 0 102 102 100 105 1 99 102,5 88 100 2 98 101 80 95 3 87 98,7 68 92 4 81 97,0 55 85 5 77 97,5 45 77 A különböző stabüitás az SH-csoportok különböző érzékenységére vezethető vissza. A talált stabÜitási különbségek nem voltak előre láthatók. A találmány szerinti eljárást előnyösen a (2) és 30 (3) egyenlettel szemléltetett módszer felhasználásával hajtjuk végre. A kreatinkináz-aktivitás meghatározásának a különböző betegségek felismerésében játszott nagy 35 szerepe miatt az ipar meghatározott számú próba elvégzésére alkalmas reagens-összeállításokat fog rendelkezésre bocsátani. Ezek az összeállítások a próbához szükséges reagenseket előre lemért mennyiségben és olyan formában tartalmazzák, 40 amely lehetővé teszi a kreatinkináz-aktivitás pontos meghatározását. A különböző, egymást nem zavaró szükséges alkotórészek néhány üvegben való egyesítése, reakcióelegyek előállítása és különleges kiszerelési 45 módozatok segítségével a meghatározás egyszerűen és gyorsan hajtható végre. Ennek megfelelően a találmány egyik tárgya reagens előállítása a kreatinkináz meghatározásához, amely vagy kreatin-foszfátot, ADP-t és az ATP 50 vagy kreatin meghatározására szolgáló rendszert, vagy pedig kreatint, ATP-t és az ADP vagy kreatin-foszfát meghatározására szolgáló rendszert tartalmaz, amelyben aktiválószerként N-acetü-ciszteint használunk. 55 Az előnyben részesített kivitelezési formánál a találmány szerinti reagens összetétele: 1. 3,5-15 mM imidazol 0,8-3,5 mM glükóz 0,3—1,5 mM magnézium-acetát 0,5-2,5 mM alkáli-azid 0,1-0,4 mM EDTA (etüén-diamin-tetraecetsav) 60 ml 6,5-7,0 pH-jú vízben oldva 60 65 2. 0,04-2,0 mM ADP 0,02-1 mM NADP-Na2 0,3-1 mM AMP-Na2 oldatként 3 ml vízben oldva, vagy liofüizátum alakjában 3. 0,5-3 mM kreatin-foszfát 5 ml vízben, vagy liofüizátum formájában 4. 30-350 E hexokináz 30-350 E glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz (G6P-DH) 1 ml glicerin/víz 1 :1 elegyben 5. 0,3—3,0 mM N-acetü-cisztein 2 ml vízben, vagy liofüizátum alakjában. Ezen előnyben részesített reagens fenti 1—5 alkotórészeit célszerűen száraz formában, vagy oldat alakjában öt különálló edényben, például palackban tartjuk és a meghatározáshoz az alábbiakban megadott módon elegyítjük őket. Különösen előnyös kivitelezési formánál a találmány szerinti reagens csak két különböző keverékből áll, melyek közül az 1. keverék: 3,5—15 mM imidazol 0,8- 3,5 mM glükóz 0,3— 1,5 mM magnézium-acetát 0,5— 2,5 mM alkáli-azid 60 ml 6,5-7,0 pH-jú vízben oldva és a 2. keverék: 0,2 - 0,6 mM ADP 1,0 - 5,0 mM AMP 0,05- 0,5 mM NADP 5,0 -20,0 mM kreatin-foszfát 2,0 - 5,0 mM N-acetü-cisztein 100- 300 E hexokináz 100-1500 E G6P-DH 100 mg szérumalbumin 100 ml pH 6,5-7,0 vízben oldva, vagy liofüizálva. 3