165888. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a reagens kreatinkináz meghatározásához
7 165888 8 A reagens ezen kiviteli alakjánál az oldat formájú 1. keverékből bizonyos mennyiséget használunk a szilárd formájú 2. keverék meghatározott részének feloldásához, vagy az előbbit a 2. keverék oldatának megfelelő mennyiségével elegyít- 5 jük. A találmány a kreatinkináz-meghatározás megbízhatóságát észrevehetően fokozza a megfelelőbb stabilizátor alkalmazása által. Ez a stabilizátor a NAC, melynek nincs fehérjedenaturáló hatása, gyakorlatilag szagtalan, vízben nagyon jól oldódik és az eddig előnyben részesített glutation-aktivátornak mintegy tizedrészébe kerül. A következő példák megvilágítják a találmány szerinti eljárás és reagens előnyben részesített kiviteli formáit. 10 1. példa 1. oldat: 2. oldat: 3. oldat: 4. oldat: 5. oldat: 7,0 mM imidazolt 1.6 mM glükózt 0,73 mM magnézium-acetátot 1.07 mM nátrium-azidot 0,22 mM EDTA-t feloldunk 50 ml kétszer desztillált vízben, az oldat pH-ját 2 N ecetsavval 6,8-ra állítjuk be és vízzel 60 ml-re feltöltjük. 0,06 mM ADP-t 0,037 mM NADP-Na2 -t 0,46 mM AMP-Na2 -t feloldunk 3 ml vízben és megfelelő palackban gyorshűtéses fagyasztással megszárítjuk. 2,10 mM kreatin-foszfátot feloldunk 5 ml vízben és alkalmas palackban liofilizáljuk. 175 E hexokinázt 175 E G6P-DH-t feloldunk 1 ml 50%-os glicerinben. 0,7 mM N-acetil-ciszteint feloldunk 2 ml vízben és alkalmas palackban liofilizáljuk. 45 50 55 Ebben a formában a reagens-keverékek legalább 1 évig eltarthatok 4°-on és 4 hétig 33°-on. A reakcióelegy elkészítéséhez a 2, 3. és 5. palackok tartalmát az 1. oldatban feloldjuk. Ez az 60 oldat +4°-on legalább 6 hétig tárolható. A kreatinkináz-aktivitást a következők szerint határozzuk meg: 2,50 ml reakcióelegyet és 0,10 ml szérumot 65 küvettába pipettázunk, egymással elegyítjük és 25°-on 5 percig inkubáljuk. 0,02 ml 4. oldat hozzáadása után a 340 nm, 334 nm vagy a 366 nm hullámhosszak pontos izolálását megengedő alkalmas fotométerben az extinkciót lemérjük és az extinkció növekedését az 1. perctől az 5. percig követjük. Az 1 percre eső extinkció-különbségeket egy faktorral megszorozva megkapjuk a szérum kreatinkináz-aktivitását. 15 2. példa 1. oldat: 7,0 mM imidazolt 1,6 mM glükózt 0,73 mM magnézium-acetátot 20 1>07 mM nátrium-azidot 0,22 mM EDTA-t feloldunk 50 ml kétszer desztillált vízben, az oldat pH-ját 2 N ecetsavval 6,8-ra 25 állítjuk be és vízzel 60 ml-re feltöltjük. 2. oldat: 0,25 mM ADP-t 2,50 mM AMP-t 30 0,15mMNADP-t 8,75 mM kreatin-foszfátot 2,5 mM N-acetil-ciszteint 700 E hexokinázt 350 E G6P-DH-t 35 100 mg szérumalbumint feloldunk 80 ml kétszer desztillált vízben, az oldat pH-ját hígított nátronlúggal, illetve ecetsavval 6,8-ra 40 állítjuk be, kétszer desztillált vízzel 100 ml-re feltöltjük és l.Oml-enként alkalmas palackokba töltjük. Az oldatot liofilizáljuk. A próbához egy palack tartalmát 2,50 ml 1. oldatban feloldjuk, hozzáadunk 0,1 ml szérumot és a kreatinkináz-aktivitást az 1. példában leírtak szerint határozzuk meg. A fentiekben a találmány előnyben részesített, az (1) reakcióban képződött ATP meghatározásán alapuló kiviteli formáját írtuk le. Hasonló módon és hasonló előnyökkel használható azonban, ha a kreatinkináz meghatározására szolgáló egyéb módszerek egyikéből indulunk ki, minthogy minden esetben a kreatinkináz aktiválódásának ugyanaz a jelentősége, különösen, ha ezen enzim meghatározását testnedvekben, mint szérumban végezzük el. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás kreatinkináz meghatározására, melyben kreatinfoszfátot ADP-vel reagáltatva kreatinná és ATP-vé alakítjuk át SH-csoportokat tartalmazó 4
