165888. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a reagens kreatinkináz meghatározásához

3 165888 4 Régóta ismeretes, hogy a kreatinkináz meghatározására szolgáló eljárásoknál SH-csoportokat tartalmazó aktiválószer hozzáadása szükséges. Erre a célra már a legkülönbözőbb SH-csoport tartalmú vegyületeket ajánlották, így ciszteint, glutationt, merkapto-etanolt, merkapto-acetátot, ditiotreitet, dititoeritritet stb. Az eddig aktiválószerként ajánlott SH-csoportokat tartalmazó vegyületeknek azonban a legkülönbözó'bb hátrányaik vannak. így ciszteinoldatok hajlamosak a kikristályosodásra, gyorshűtéses fagyasztással előállított készítmények bizonyos idő múlva már nem oldódnak fel teljesen. Merkaptoetanol, merkapto-propanol, merkapto-acetát, tioglikolát stb. intenzív kellemetlen szaga miatt alig használható. Ditiotreit, ditioeritrit, cisztein-metilészter stb. a levegő oxigénje által nagyon könnyen oxidálódik és ekkor elveszti aktiváló tulajdonságát. Amino-etil-izotio-urónium-bromid erős fehérjedenaturáló hatással rendelkezik, ezért ezt az anyagot nem lehet fehérjékkel, például albuminnal, hexokinázzal, G6P-DH-val stb. együtt liofilizálni. Más anyagok, mint guanil-cisztein vagy karbamoil-cisztein, nagyon nehezen oldhatók fel. Ezért eddig a glutationt választották aktiválószerként. 1970-ben és 1972-ben a Német Klinikai Kémiai Társaság [Z. klin. Chem. u. klin. Biochem. 8, 658-59 (1970) és 10, 185-86 (1972)] a kreatinkináz-aktivitásmérési módszerének szabványosítását ajánlotta. Az említett közleményekben aktivátorként a glutation használatát ajánlják. Ez a vegyület viszonylag állandó, csaknem szagtalan, a GSSG oxidációs termék könnyen oldódik és nem denaturálja a fehérjéket. Mégis a vizsgált szérumpróbák egy részénél túlságosan alacsony kreatinkináz-aktivitást találtak glutationoldatok, vagy hosszabb ideig tárolt liofilizált glutation használata esetén. A talált aktivitás 5 már nem felel meg a kórképnek. Különösen szívinfarktusnál azonban feltétlenül fontos, hogy fellépése után lehetőleg hamar pontos kreatinkináz-aktivitást határozzanak meg. Az 50 egység/liter normálértéket meghaladó aktivitásemelkedés nagysá-10 gából az infarktus kiterjedésére lehet következtetni és ezek alapján az orvos megteheti a szükséges intézkedéseket. A találmány feladatát ezért kreatinkináz meghatározására szolgáló eljárás és reagens létrehozása 15 jelentette, olyan aktiválószer használatával, amely nem mutatja az eddig ismert aktivátorok hátrányait. A találmány szerint ezt a feladatot olyan eljárással oldottuk meg, melyben a kreatinkináz 20 meghatározása céljából kreatin-foszfátot ADP-vel kreatinná és ATP-vé alakítunk át SH-csoportokat tartalmazó aktiválószer jelenlétében és a reakcióban részt vevő egyik vegyület mennyiségi változását mérjük. Az átalakítást N-acetil-cisztein aktivátor 25 jelenlétében hajtjuk végre. A találmány szerinti aktivátorral a kreatinkináz-aktivitás hosszú időn keresztül változatlan marad, és még akkor is, ha az aktiválószer oldat formájában van jelen, az aktivitás hetekig tartó tárolás után sem változik. 30 A találmány szerint használt N-acetil-cisztein (NAC) fölényét az eddig előnyben részesített glutationnal szemben a következő I táblázat mutatja. Ebben 15 különböző szérum aktivitás-33 meghatározásának eredményei láthatók, amelyeket frissen előállított glutation- (GSH), illetve NAC-oldattal, és 6 hétig 4°-on tárolt GSH-, illetve NAC-oldattal kaptunk. I. táblázat Szérum Frissen 6 hétig 4°-on előállított tárolt GSH-GSH-oldattal E/l oldattal E/l Frissen előállított NAC-oldattal E/l 6 hétig 4 -on tárolt NAC-oldattal E/l 1 30 2 58 3 107 4 124 5 230 6 33 7 75 8 132 9 190 10 239 11 20 12 49 13 115 14 180 15 231 19 44 95 109 219 10 55 115 170 220 0 2 70 140 190 32 60 105 130 235 35 80 130 185 245 24 52 110 185 235 30 60 104 125 230 30 78 128 180 240 20 47 110 179 225