165733. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a vér kalciumszintjét leszállító hatású polipeptidek előállítására
165733 11 12 formamid elegyben, és 44 ml hidrazinhidrátot adunk hozzá. Szobahőmérsékleten való 4 napi állás után az oldatot teljesen bepároljuk. A maradékot acetonitrilben kiforraljuk. Körülbelül 20° -ra való hűtés után szűrjük. Z—His— -I^s(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNH2 -t kapunk. Olvadáspontja: 175°, [a]D°=-58°, metanolban. E( szekvenciarész: H— His—Lys(BOC)-Leu--Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 A módszer 10 g heptapeptidet (Di szekvenciarész) feloldunk 100 ml dimetilformamidban, bepároljuk, a maradékot 100 ml dimetilformamidban oldjuk, hozzáadunk 15 g N-hidroxiszukcinimidet, lehűtjük 0°-ra, hozzáadunk 5 g diciklohexilkarbodiimidet, 3 óra hosszat reagáltatjuk, a kivált diciklohexil karbamidot kiszűrjük, 30 ml-re besűrítjük, és a keletkező Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OSU heptapeptidoxiszukcinimidésztert éter hozzáadásával leválasztjuk. Éterrel való mosás után a maradékot 100 ml dimetilformamidban oldjuk, 10 g nonapeptidamiddal (C! szekvenciarész) reagáltatjuk, és 16 óra hosszat reagálni hagyjuk. Hozzáadunk 500 ml etilacetátot és szűrjük. A maradékot dimetilformamidban oldjuk, hozzáadunk 10 ml ecetsavat és etilacetáttal ismét leválasztjuk. Szűrjük, etilacetáttal és éterrel mossuk és szárítjuk. Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr- Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 • CH 3 COOH-t kapunk. [a]*,0 = = -24°, közvetlenül feloldjuk 80%-os ecetsavban. (1 g védett hexadekapeptidre 20 ml 80%-os ecetsavat veszünk.) Ezután hozzáadunk 5 g palládiumszenet, és normál nyomáson és szobahőmérsékleten hidrogénezzük. Szűrjük, 20°-on nagyvákuumban bepároljuk, és a száraz maradékot éterrel mossuk. Káliumhidroxid forgácson való szárítás után az E! szekvenciarészt triacetát alakban kapjuk. Olvadáspontja: 185° (bomlik), [a]l° = -42° n ecetsavban. B módszer 12 g nonapeptidet (C5 szekvenciarész) feloldunk 1000 ml dimetilformamid és víz elegyben, hozzáadunk 1,8 g palládiumszenet, és normál nyomáson hidrogénezzük. A katalizátort kiszűrjük, és a szűrletet vákuumban 60 ml-re besűrítjük. A H - A rg- Thr - A sn -Thr-Gly- Val-Gly-Ala-Pro-NH2 oldatát-20°-on félretesszük. 10 g Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNH2-nek(D 2 szekvenciarész) 100 ml dimetilformamiddal készült — 15°-ra lehűtött oldatához hozzáadjuk 21 ml 1,85 n dioxános sósav oldatát, és 1,1 ml terc-butilnitritet. Tíz percig —15°-on keverjük, majd -30°-ra lehűtjük, hozzáadunk 6 ml trietilamint, és hozzászűrjük a H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 dimetilformamiddal készült hideg oldatához. 90 percig 0°-on való keverés után az oldatot vákuumban besűrítjük, kloroformot adunk hozzá, s csapadékot kiszűrjük, kloroformmal mossuk, 5 majd etilacetáttal, és szárítjuk. A nyers terméket feloldjuk metanol, kloroform és víz elegyében, és kovasavgél oszlopra visszük. Eluáljuk, a tiszta frakciókat egyesítjük, és vákuumban szárazrapároljuk. A maradékot metanolban oldjuk, a 10 terméket etilacetáttal leválasztjuk, szűrjük, és szárítjuk. Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2-t kapunk. Olvadáspontja: 185° (bomlik), [a]o° = — 29°, dimetilformamidban. 15 3.68 g-ot a kapott hexadekapeptidből feloldunk 120 ml dimetilformamid és víz elegyben, 10 ml vízben szuszpendált 3g 10%-os palládiumszenet adunk hozzá, és katalitikusan hidrogénezzük. Körülbelül 2 óra múlva a számított mennyiségű 20 hidrogén gyakorlatilag elhasználódik. Ezután a katalizátort kiszűrjük, és a szűrletet teljesen be párolva az E! szekvenciarészt kapjuk. E2 szekvenciarész: H-His—Lys(BOC)-Leu— 25 -Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH2 A módszer 30 Az Ej szekvenciarész előállításának A módszerével analóg módon a Dt szekvenciarész heptapeptidből és a C2 szekvenciarész nonapeptidből az E2 szekvenciarészt állítjuk elő triacetát alakjában. Olvadáspontja 164° (bomlik), [Ű]D° = 35 =-19°, dimetilformamidban. B módszer 40 30 g nonapeptidet (C6 szekvenciarész) feloldunk 450 ml dimetilformamidos víz elegyben, hozzáadunk 3 g palládiumszenet, és normál nyomáson hidrogénezzük. A katalizátort kiszűrjük, és a szűrletet vákuumban 250 ml-re besűrítjük. A 45 kapott H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH2 oldatot -20° -on félretesszük. 24 g Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNH2 (D 2 szekvenciarész) 200 ml dimetilformamiddal készült —15°-ra lehűtött oldatához 50 hozzáadunk 52 ml 1,85 n dioxános sósavat és 2,6 ml terc-butilnitritet. Tíz percig -15°-on keverjük, majd -30°-ra lehűtjük, hozzáadunk 14 ml trietilamint, és hozzászűrjük a H—Arg—Thr—Asn— -Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH2 dimetilforma-55 middal készült hideg oldatához. 90 percig 0°-on való keverés után az oldatot vákuumban bepároljuk, kloroformot adunk hozzá, a csapadékot kiszűrjük, kloroformmal, majd etilacetáttal mossuk, és szárítjuk. A nyers terméket metanol, 60 kloroform és víz elegyben feloldjuk, és kovasavgél oszlopra visszük. Eluáljuk, a tiszta frakciókat egyesítjük, és vákuumban szárazrapároljuk. A maradékot metanolban oldjuk, a terméket etilacetáttal leválasztjuk, szűrjük, és szárítjuk. 65 Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-6
