165733. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a vér kalciumszintjét leszállító hatású polipeptidek előállítására
13 165733 14 -Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Val-Pro-NH2 -t kapunk. Olvadáspontja: 180° (bomlik), [aß0 = -30°, dimetilformamidban. A kapott hexadekapeptid 6,75 g-ját feloldjuk 220 ml metanol és víz elegyben, 6g 10%-os palládiumszenet 20 ml vízben szuszpendálunk, hozzáadjuk, és katalitikusan hidrogénezzük. Körülbelül 2 óra múlva a számított hidrogénmennyiség gyakorlatilag elhasználódik. A katalizátort kiszűrjük, a szűrletet teljesen bepárolva az E2 szekvenciarészt kapjuk. Fi szekvenciarész: Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-NHNH2 a) Z-Asp(OTB)-Leu-OMe 151 g Z-Asp(OTB)-OH-t [előállítását közli a Ber. 99, 105 (1966)] és 54 g N-hidroxiszukcinimidet feloldunk 700 ml acetonitrilben, és -20°-ra lehűtjük. Ezután hozzáadjuk 96,5 g diciklohexil karbodiimidnek 350 ml acetonitrillel készült oldatát. Körülbelül 30 perces állás után a keletkezett diciklohexilkarbamidot kiszűrjük. A szűrlethez 71,2 g H—Leu—OMe-t adunk, majd 4 óra hosszat állni hagyjuk, és vákuumban bepároljuk. A szilárd maradékhoz etilacetát és víz elegyét adjuk. A szerves fázist 5n nátriumhidrogénkarbonát oldattal, vízzel és híg kénsav oldattal (pH = 3) mossuk, a semlegesre való mosás után nátriumszulfáton szárítjuk, és bepároljuk. A maradékot kloroformban oldjuk, amelyhez 1% metanolt adtunk, és 10-szeres mennyiségű kovasavgél oszlopon szűrjük. Z—Asp(OTB)—Leu— -OMe-t kapunk. Olvadáspontja: 58°, [aß0 =-16°, dimetilformamidban. b) Z-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe 118 g Z-Asp(OTB)-Leu-OMe-t feloldunk 2000 ml metanolban. Ezután 15 g 10%-os palládiumszenet 63 ml 4 n sósavval összekeverünk, és az oldathoz adjuk. Két óra hosszat szobahőmérsékleten és normál nyomáson hidrogénezzük. Az elméleti hidrogénmennyiség körülbelül 85%-a fogy el. A katalizátort kissűrjük, és a szűrletet teljesen bepároljuk, amikor is a H—Asp(OTB)-Leu— -OMe • HCl-t amorf hab alakban kapjuk. 91,7 g Z-Gln-ONP-t [előállítását közli a Chem. Pharm. Bull. Jap. 18, 784 (1970)] és 93,8 g H-Asp(OTB)-Leu-OMe • HCl-t feloldunk 500 ml dimetilformamidban, és hozzáadunk 51 ml N-metilmorfolint. Szobahőmérsékleten 15 óra hosszat állni hagyjuk, majd az oldatot vákuumban teljesen bepároljuk. A kapott maradékot vízzel jól összekeverjük, majd a vizet kiszűrjük. Ezután metanolból átkristályosítjuk. Z-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe-t kapunk. Olvadáspontja: 189 (bomlik), [aß0 = -30°, dimetilformamidban. c) Z-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe 44,4 g Z-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe-t eloldunk 1200 ml metanol és dimetilformamid elegyben. Ezután 15 g 10%-os palládiumszenet hozzáadunk 50 ml vízhez, majd az oldathoz adjuk. Két óra hosszat való hidrogénezés után a számított mennyiségű hidrogén majdnem teljesen elfogy. A 5 katalizátort kiszűrjük, és a szűrletet vákuumban bepároljuk. 21,4 g Z-Ser-NHNH2 [előállítását közli a J. Biol. Chem. 146, 463 (1942)] 100 m( dimetil-10 formamiddal készült oldatát — 20°-ra lehűtjük, és hozzáadunk 50,6 ml 5n éteres sósavat és 10,3 ml terc-butilnitritet. Tíz perces keverés után a pH értékét 35,6 ml trietilaminnal 7,5-re beállítjuk, és hozzáadjuk 34,2 g H-GLl-Asp(OTB)-Leu-OMe 15 100 ml dimetilformamiddal készült oldatát. Négy óra hosszat 20°-on keverjük, a kivált trietilaminhidrokloridot kiszűrjük, és a szűrletet teljesen bepároljuk. A maradékot vízben oldva, majd víz és metanol elegyből átkristályosítva a nyers 20 terméket kovasavgél oszlopon kloroform és metanol eleggyel szűrve tisztítjuk. Z-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe-t kapunk. Olvadáspontja: 172°, [aß 0 =-24°, dimetilformamidban. d) Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-NHNH2 50,8 g Z-Lys(BOC)-Leu-OMe-t [előállítását 30 közli a Helv. Chim. Acta 52, 1789 (1969)] feloldunk s600 ml etilacetátban, és 25 ml 4 n éteres sósav és 3g 10%-os palládiumszén hozzáadása után katalitikusan hidrogénezzük. Körülbelül 4 óra múlva a számított mennyiségű hidrogén 35 teljesen elhasználódik. A katalizátort kiszűrjük, és a szűrletet térfogatának felére besűrítjük. 33,0 g Trt-Gly-OH-t [előállítását közli a J. Ara Chem. Soc. 81, 2884 (1959)] és 12,0g N-hidroxiszukcinimidet feloldunk 150 ml dimetil 40 formamidban és -15°-ra lehűtjük. Hozzáadjuk 21,6 g diciklohexilkarbodiimidnek 100 ml acetonitrillel készült oldatát, és a keveréket időnként megrázva 3 óra hosszat szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A kikristályosodott diciklohexil-45 karbamidot kiszűrjük, és a szűrlethez 25 ml N-metilmorfolin hozzáadása közben a fenti hidrogénezéssel kapott dipeptidoldatot adjuk. 16 órai állás után teljesen bepároljuk. A maradékot etilacetátban oldjuk, és 0 -on n kénsav oldattal és 50 5% nátriumhidrogénkarbonát oldattal mossuk. Nátriumszulfáton való szárítás után a szerves fázist teljesen bepároljuk. A kapott hab kovasavgél oszlopon kloroform és metanol eleggyel való szűrése és a szűrlet bepárlása után a Trt-Gly-55 -Lys(BOC)-Leu-OMe-t amorf hab alakjában kapjuk. [aß 0 = -10°, metanolban. A maradékot 300 ml metanolban oldjuk, hozzáadunk 17 ml hidrazinhidrátot, és 16 óra 60 hosszat szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Teljes bepárlás és nagyvákuumban való szárítás után kloroform és metanol eleggyel kovasavgél oszlopon szűrjük. Kloroform és petroléter elegyből való kristályosítás után Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-65 -NHNH2 -t kapunk. Olvadáspontja: 175°, 7
