165725. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új enzimkészítmény előállítására
165725 15 16 szűrőlepényt 20 cm3 TRIS-foszfát kiegyenlítő oldattal (pH = 6,0, 0,02 mólos) vesszük fel. Miután a fel nem oldódott részeket centrifugálással eltávolítottuk, az oldatot 0,8—1,0 cm3 /perc sebességgel 200 cm3 , előzetesen ugyanezzel a kiegyenlítő oldattal kiegyensúlyozott DEAE-Sephadex A—50 oszlopra öntjük, és 800 cm3 TRIS-foszfát kiegyenlítő oldattal (pH = 6,0, 0,02 mólos) mossuk. A trombinszerű enzimet ezután 400 cm3 TRIS-foszfát kiegyenlítő oldattal (0,04 mólos, pH = 6,0) eluáljuk. Az aktív eluátumot nyomás alatt UM— 10 ultraszűrőn töményítjük és sómentességig mossuk. Az így kapott sűrítményből vagy közvetlenül steril injekciós oldatot készítünk, vagy azt vákuumban szárítjuk. Szárítás után kb. 200 mg kb. 120—160 NIH-trombin-egység/mg fehérjetartalom aktivitású enzimkészítményt kapunk. 3. példa 1,8 cm2 keresztmetszetű és 92 cm hosszú oszlopot megtoltunk „SEPHADEX G—100"-zal. A Sephadex gélt 10%-os vizes ecetsavval kiegyensúlyozzuk. Az 1. példában leírt eljárással előállított (II. tisztasági fokú) enzimkészítményből 6,26 mg-ot feloldunk 0,3 cm3 10°/ o -os vizes ecetsavban. Ezt az oldatot az oszlopra öntjük, majd az oszlopon alulról 5,6 cm3 sebességgel 10%-os vizes ecetsavoldatot áramoltatunk át. Két, az ultraibolyát elnyelő (280 nm) zóna keletkezik. Az első zónából származó eluátumból fagyasztvaszárítás után 4,25 mg kb. 200—250 NIH-trombinegység/mg fehérjetartalom aktivitású enzimkészítményt kapunk. 4. példa Az 1., 2. vagy 3. példa szerinti enzim oldatának alkalmazásával az emberi vér fibrinogén-mentesítésére szolgáló gyógyászati készítményt állítunk elő. 2,0 g részben hidrolizált zselatint, 30 g triklórizobutilalkoholt és 90 g nátriumkloridot 10 1 kétszer desztillált vízben oldunk. Az enzimet az oldatban oldjuk, és olyan koncentrációra állítjuk be, hogy 0,1 ml enzimoldat 0,3 ml citráttal pufferolt emberi vért koagulál 37 °C-on, 19+ 1 másodperc alatt. Az enzimoldatot legfeljebb 0,45^ pórusméretű baktériumos membránszűrőn például (Sartorius szűrőn) szűréssel sterilizáljuk. A steril oldatot nitrogénatmoszférában 2 ml-es ampullákba töltjük. Az injekciós oldat nem toxikus; ezt galambokon próbáltuk ki, intravénás adagolással (0,05 ml injekciós oldat/100 g testsúly). 5. példa A vér in vitro vizsgálatára a következők szerint készített reagenst alkalmazzuk: Az 1—3. példák bármelyike szerinti enzimet 0,5 liter 0,5%-os vizes ammóniumhidrogénkarbonát oldatban oldjuk, és olyan koncentrációra állítjuk be, hogy az enzimoldat aktivitása 70 NIH egység/ml. Az enzimoldat hígítására egy vivőanyag-oldatot alkalmazunk, melynek komponensei: glikokoll 221,1 g nátriumklorid 93,5 g polivmilpirrolidon 37,4 g metil-p-hidroxibenzoát 11,0 g részlegesen hidrolizált zselatin 11,0 g desztillált víz 10 liter Az oldat pH-értékét nátriumhidroxid oldattal 5 7,6—7,8-ra állítjuk be. A kívánt enzimhígítás meghatározására egy hígítási sorozatot készítünk, a következő komponensek elegyítésével: Enzimes oldat Desztillált víz Vivőanyag oldat 10 a) 0,3 ml 0,7 ml 9,0 ml b) 0,4 ml 0,6 ml 9,0 ml c) 0,5 ml 0,5 ml 9,0 ml d) 0,6 ml 0,4 ml 9,0 ml A hígított oldatokat megvizsgáltuk citráttal 15 pufferolt emberi plazmán. Az az oldat, amelyből 0,1 ml 0,3 ml plazma alvadását eredményezi 18+ 1 másodperc alatt 37 °C-on, megfelel a további eljáráshoz. E példa szerint a c) hígítást alkalmazhatjuk, ahol 0,5 liter enzimoldatot 0,5 liter desz-20 tillált vízzel és 9,0 liter vivőoldattal hígítottunk. Az így kapott végleges oldatot 5 ml-es üvegekbe töltjük, üvegenként 1,0+0,05 ml oldatot adagolunk. Az üvegek tartalmát szárazon fagyasztjuk —50—70 °C-on 48 óra hosszat. Az üvegeket nitro-25 génnel megtöltjük és gumidugókkal zárjuk. Minden üveg kb. 34 mg száraz vegyületet tartalmaz, 1%-nál kevesebb nedvességtartalommal. Egy üveg tartalmát 1,0 ml desztillált vízben feloldva 7,4— 7,5-os pH-jú enzimoldatot kapunk, amelyből 0,1 ml 30 0,3 ml citráttal pufferolt emberi plazma koagulálását okozza 20+2 másodperc alatt, 34 °C-on. 6. példa 20 g Bothrops jararac mérget 1000 ml 0,9%-os 35 vizes nátriumklorid-oldatban oldunk. A pH-t 6,5-re állítjuk be 10%-os vizes NaOH-oldat segítségével, majd 670 ml telített ammóniumszulfát-oldatot adagolunk. Az oldatot egy órán keresztül 20 °C-on állni hagyjuk, ezután centrifugáljuk. A centri-40 fugáit anyaghoz további 552 ml telített ammóniumszulfátot adunk. Egy óra eltelte után a képződött csapadókot centrifugálással elkülönítjük és 100 ml desztillált vízben oldjuk. 10%-os ecetsavval a pH-t 4-re állítjuk be, majd az oldatot 40 °C-ra 45 melegítjük, és 30 percig ezen a hőmérsékleten tartjuk. A csapadékot centrifugálással elkülönítjük. Ezután a centrifugált anyaghoz 2 g p-klórfenolt adunk. Az elegyet két óra hosszat keverjük, majd egy éjszakán át állni hagyjuk. A csapadékot centri-50 fugálással összegyűjtjük, kétszer mossuk egyenként 10 ml, p-klórfenollal telített vízzel, 50 ml 1%-os ecetsavval etanolban felvesszük, egy óra hosszat keverjük és üvegszűrőn összegyűjtjük. A szűrőpogácsát többször mossuk etanollal és ezt 55 követően vákuumban szárítjuk. Ily módon 1,4— 1,9 g enzimkészítményt kapunk, amely I. tisztasági fokú és aktivitása 14—18 NIH egység/mg. Ezt a terméket TRIS-foszfát pufferral (pH 6,0/0,08 mólos) felvesszük. Az oldatot 15 percig 60 keverjük. Az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítjuk. A centrifugált anyagot 1 ml/perc sebességgel 200 ml TRIS-foszfát pufferből (0,08 mólos) készült oszlopra öntjük, majd ugyanazon puffer segítségével eluáljuk. Az eluátumokat 65 ULTRORAC kollektorban (LKB, Stockholm) ösz-8
