165725. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új enzimkészítmény előállítására

165725 17 18 szegyűjtjük, és 15 ml-es adagokban. Az aktív frakciókat plazma alvadási vizsgálattal meghatározzuk (0,3 ml citrát plazma + 0,1 ml eluátum), majd egyesítjük. Ily módon 150—180 ml aktív eluátumot kapunk, melyet UM 10 ultraszűrőn 5 (Amicon) nyomás alatt betöményítjük, és addig mosunk, amíg az a sóktól mentessé válik. A sómentes koncentrátumot ezután fagyasztva-szárításnak vetjük alá. 250—300 mg enzimkészítményt kapunk, II. tisztasági fokkal. A készítmény akti- 10 vitása 30—35 NIH egység/mg. 7. példa 20 g Bottrops marajoensis mérget az 1., 2. vagy 6. példában leírt módon kezelünk. 175—225 mg 15 enzimkészítményt kapunk, II. tisztasági fokkal. Az enzimkészítmény aktivitása 45—50 NIH egység/mg. Ebből az enzimből 200 g-ot 1 ml desztillált vízben oldunk. Az oldatot 30x 1000 mm-es, SEPHADEX 20 G—75-tel töltött oszlopon kromatografáljuk, és kiegyensúlyozzuk 1%-os ammóniumformiát oldattal, melyet 10%-os etanollal készítünk. Az eluciót ugyanezen oldattal végezzük. Az eluátumot ULTRORAC kollektorban (LKB, Stockholm) 2,5 25 ml-es adagokban összegyűjtjük. A frakciók optikai sűrűségét átfolyásos fotométerrel (UVICORD, LKB, Stockholm) mérjük és folyamatosan regisztráljuk. Három UV abszorbeáló zónát kapunk, melyek egyikében az enzim aktivitás plazma alva- 30 dási vizsgálat útján határozzuk meg. Az aktív frakciókat egyesítjük, és fagyasztva-szárításnak vetjük alá. Ily módon 35—40 mg enzimkószítményt kapunk, amelynek tisztasági foka III., és aktivitása 200—250 NIH egység/mg. 35 8. példa 20 g Bothrops mojeni mérget az 1., 2. vagy 6. példában leírt módon kezelünk. 200—250 mg enzimkészítményt kapunk, melynek tisztasági foka II., 40 és aktivitása 35—40 NIH egység/mg. Ebből az enzimkészítményből 200 mg-ot a 6. vagy 7. példában leírtak szerint kezelünk. Két UV-abszorbeáló zónát kapunk. Az aktív eluátumot fagyasztva-szárítás után 30—40 mg mennyi- 45 ségben kapjuk, III. tisztasági fokkal, aktivitása 200—250 NIH egység/mg. 9. példa 20 g Bothrops lanceolatus mérget az 1., 2. vagy 50 6. példában megadott módon kezelünk. Ily módon 15—20 mg enzimkészítményt kapunk, II. tisztasági fokkal, 25—30 NIH egység/mg aktivitással. 10. példa 55 20 g Bothrops jararaca mérget az 1., 2. vagy 6. példában megadottak szerint kezelünk. 25—30 mg enzimkészítményt kapunk, melynek tisztasági foka IL, aktivitása 30—35 NIH egység/mg. 60 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás embernél ós emlős állatoknál való alkalmazáskor alacsony dózisnál vérzéscsillapító 65 hatást és magasabb dózisnál véralvadásgátló hatás mutató enzimkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, a Bothrops törzshöz tartozó kígyós például Bothrops atrox kígyó mérgéből vagy valamely más, a Bothrops atrox méreggel immunológiai keresztreakciót adó kígyóméregből 4,5—7 pH-jú izotóniás vizes oldatot készítünk, majd a) az említett izotóniás oldatot frakcionált kisózásnak vetjük alá, előnyösen ásványi savak ammónium-, alkálifém- vagy alkáliföldfém-sói, így nátriumklorid vagy -szulfát, magnéziumklorid vagy -szulfát, vagy ammóniumklorid vagy -szulfát alkalmazásával, a ballasztanyagokat előnyösen centrifugálással eltávolítjuk és az enzimanyagot tartalmazó kicsapott frakciót desztillált vízben oldjuk, a pH-t 3—4-re állítjuk be, ásványi sav, így sósav vagy kénsav alkalmazásával, vagy szerves savval, mint ecetsavval az oldatot néhány perctől 2 óráig terjedő időtartaomn át 30—50 °C-on tartjuk, a kivált fehérjéket elkülönítjük, és a visszamaradó oldat pH-ját 4—6-ra állítjuk be, vagy b) az izotóniás oldat pH-ját 3—4-re állítjuk be, például az a) alatt említett reagensekkel, az oldatot néhány perctől két óráig terjedő időtartamon át 30—50 °C-on tartjuk, a kivált fehérjéket elkülönítjük, a visszamaradó oldat pH-ját 4,5—7-re állítjuk be, és azt frakcionált kisózásnak vetjük alá, előnyösen az a) alatt említett vegyületek alkalmazásával, a ballasztanyagokat előnyösen centrifugálással eltávolítjuk, és az aktív enzimanyagot tartalmazó kicsapott frakciót desztillált vízben oldjuk, az oldat pH-ját kb. 4—6-ra állítjuk be, és az a) vagy b) változat bármelyikével kapott oldathoz fenolt vagy valamely fenol-származékot, például egy fenolkarbonsavat, így szalicilsavat, egy alkilfenolt, így o-, m- vagy p-krezolt, egy halogénezett fenolt, így o-, m- vagy p-klórfenolt, egy halogénezett vagy alkilezett fenolkarbonsavat, így krezolkarbonsavat vagy klórfenolkarbonsavat, vagy az említett fenolszármazékok sóját, így nátriumszalicilátot, vagy nátriumkrezolkarboxilátokat adunk, ily módon az enzimet tartalmazó oldhatatlan komplexet csapunk ki, majd c) a kompexet poláros szerves oldószerben híg ecetsavval, előnyösen 0,1—0,5%-os vizes ecetsavval elbontjuk és elkülönítjük a felszabadult, oldatba nem ment enzimet, vagy d) a komplexet vizes közegben valamely bázissal, előnyösen alkálifémhidroxiddal, alkálifémacetáttal, alkálifémcitráttal, alkálifémkarbonáttal vagy -hidrokarbonáttal, di- vagy trialkálifémfoszfáttal, ammóniumhidroxiddal vagy ammóniával kezeljük, 7,5—8,5 körüli pH-értéken, a felszabadult enzimet ultraszűréssel, dialízissel vagy gél szűréssel elkülöntíjük, és az így kapott enzimet ismert módon tovább tisztítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a frakcionált kisózást ásványi savak ammónium-, alkáli-fém vagy alkáli-földfém sóival végezzük. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az oldhatatlan komplex kicsapására fenolszármazékként fenolkarbonsavat, metilfenolt, halogénezett 9