165725. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új enzimkészítmény előállítására

165725 9 10 fiával kapott enzimkészítmények biológiai aktivitása a kb. 200 és a 400 NIH-trombin egység/mg fehérjetartalom (III. tisztasági fok) között változik. A gélkromatográfia az enzimkészítmóny hatástalan frakciójának jelentékeny hányadát távolítja el. Az itt használt „II. tisztasági fok" és „III. tisztasági fok" kifejezések jelentése a következő: II. tisztasági fok = kb. 100—200 NIH-trombin egység/mg fehérjetartalom; III. tisztasági fok = kb. 200—400 NIH-trombin egység/mg fehérjetartalom. Az enzimkészítmény aminosav analízisének eredménye a készítmény tisztaságának függvényében a következőkben ismertetett közelítő határértékek között változhat. Az aminosav elemzést oly módon végeztük, hogy az enzimkészítményt 110 °C hőmérsékleten, nitrogén légkörben 22—72 órán át, állandó forrásban tartott sósavval hidrolizáltuk. Aminosavak Mikromól per mg peptid összetevő Aszparaginsav 1 —1,3 Treonin 0,35—0,55 Szerin 0,4 —0,5 Glutaminsav 0,65—0,75 Prolin 0,55—0,9 Glicin 0,65—0,9 Alanin 0,4 —0,65 1/2 Cisztin 0,35—0,6 Valin 0,45—0,6 Metionin 0,1 —0,2 Izoleucin 0,45—0,75 Lezuin 0,45—0,65 Tirozin 0,3 —0,5 Fenilalanin 0,3 —0,45 Hisztidin 0,2 —0,25 Lizin 0,45—0,65 Arginin 0,3 —0,45 Példaként ismertetjük az aminosavelemzós néhány értékét egy A = II. tisztasági fokú enzimkószítményre, és B = III. tisztasági fokú enzimkészítményre (azaz lényegesen csökkent hatástalan anyag tartalmú enzimkészítményre) vonatkozóan: Aminosavak peptidtartalom A B Aszparaginsav 1,05—1,1 1,17—1,25 Treonin 0,35—0,41 0,42—0,54 Szerin 0,43—0,45 0,41—0,5 Glutaminsav 0,67—0,7 0,66—0,71 Prolin 0,58—0,76 0,79—0,87 Glicin 0,67—0,76 0,76—0,9 Alanin 0,41—0,5 0,63—0,64 1/2 Cisztin 0,47—0,6 0,35—0,42 Valin 0,47—0,55 0,55—0,6 Metionin 0,17—0,2 0,13—0,17 Izoleucin 0,45—0,55 0,65—0,72 10 Aminosavak peptidtartalom A B Leucin 0,46—0,47 0,6 —0,64 Tirozin 0,33—0,5 0,3 —0,36 Fenilalanin 0,33—0,43 0,33—0,38 Hisztidin 0,2 —0,22 0,21—0,23 Lizin 0,5 —0,64 0,48—0,53 Arginin 0,3 —0,4 0,32—0,36 A találmány szerinti enzimkészítmény szénhidrát összetevője megállapításunk szerint legis alábbis részben glikopeptid alakjában polipeptidhez kötődik. A szénhidrátot (közömbös cukor) az orcin-módszerrel határoztuk meg (v. ö. L. F. Hewitt, Biochem. J. 31, 360, 1937). Úgy látszik, hogy a III. tisztasági fokú enzim-20 készítmény (azaz a csökkent hatástalan anyag tartalmú készítmény) kb. 38 000 és 55 000 közötti valószínű molekulasúlyú peptid összetevőt tartalmaz. A II. tisztasági fokú enzimkészítmény peptid összetevőjének molekulasúlya kb. 28 000— 25 55 000. Az enzimkészítmóny II. tisztasági fokú alakjában nyilvánvalóan tartalmaz egy, a XIII-as faktort aktiváló összetevőt. Nagymértékben tisztított állapotban (III. tisz-30 tasági fok) az enzimkészítmény az N-végcsoportú láncvégződéstől kiindulva, a „Protein Sequence Determination" (Fehérje sorrend meghatározás), S. B. Needleman, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg, New York, 1970. 221. old. c. munkában le-35 írt Edman-féle lebontási módszerrel meghatározott aminosav sorrendje a következő: valine-izoleucin ->- glicin -*• glicin -» aszparginsav ->- glutaminsav. A találmány szerinti eljárással előállított enzim-40 készítmény mentes az idegrendszerre károsan ható neurotoxinoktól, bradikinin-alkotó proteázoktól (a bradikinin vérnyomáscsökkentő hatást fejt ki), foszfolipázoktól (amelyek hemolitikus hatásúak és vesekárosodásokat okoznak), aminosav oxidá-45 zoktól és foszfatázoktól. A találmány szerinti eljárással előállított enzimkészítmény felhasználható vegyszerként és segédvegyszerként in vitro alvadás-fíziológiai vizsgálatokban, például a fibrinogén-fibrin átalakulás vizs-50 gála tára heparin és antitrombinok jelenlétében, a fibrinopeptidekkel, kóros fibrinogen szerkezetekkel, fibrinogen bomlástermékeivel, a VIII-as faktorral és a XIII-as faktorral kapcsolatos vizsgálatokban. 55 Mérsékelt adagokban in vivo adva, a találmány szerinti eljárással előállított enzimkészítmény a kísérleti állatoknál és betegeknél a hemosztázis normális vagy kóros állapotaiban egyaránt csökkenti a vérzést és az alvadási időt. Mérsékelt ada-60 gokban intravénásán egészséges embernek adva, az enzimkészítmény a keringő vérben oldható fibrin-fibrinogén komplexek keletkezését idézi elő, amint azt a plazmában végrehajtott pozitív kriofibrin és parakoagulációs tesztek, valamint a bete-65 gektől vett plazmafrakciók N-végcsoport elemzé-5