165648. lajstromszámú szabadalom • Eljárás O-hidroxi-benzoesav alapú homo polimerek és enzimek komplexeinek előállítására
11 165648 12 mosást acetát-pufferrel (1 ml, pH 4,5) végezzük. A glükamiláz aktivitását meghatározva az alábbi értékeket kapjuk. Aktivitás1 ^ (mg/l/m) Első felülúszó fázis 1. mosó puffer 2. mosó puffer Standard 14 5 0 18 10 D standard keményítő-oldatból kiválasztott glükóz súlya. ,A fenti eredmények azt mutatják, hogy a poli-5-sav 4,5 pH-értéken csak kismértékben képes a glükamilázt komplexbe vinni (lásd még később az 5. és a 12. példát). Poli-5-sav előállítása A példa a), b) és c) részében használt poli-5-savat az 1. példában a poli-4-sav előállítására ismertetett módon nátrium-4-amino-szalicílát helyett 5-amino-szalicilsavat (40 g) használva állítjuk elő. így 25,8 g N-akriloil-5-amino-szalicilsavat kapunk 218-219 C°-os olvadásponttal. Elemzési eredmények: számított: talált: C = 58,0%, N = 6,75%, C = 57,5%, N = 6,5%. H = 4,35%, H = 4,5%, 15 20 25 30 A polimer végtermék rózsaszínű. oldatát adjuk és a kapott keverékeket mintegy 4C°-on 16 órán át keverjük. Ezután a keverékeket centrifugáljuk és az egyes felülúszó fázisokat elkülönítjük. A kiindulási enzim-oldatból és a kapcsolási reakció után minden egyes felülúszó fázisból aliquot (25 /ni) mintát veszünk. Az aliquot mintákat elemzésnek vetjük alá, hogy megállapíthassuk, milyen mértékben köt meg az adott polimer enzimet. A mintákat ötször desztillált vízzel mossuk (az egyes mosások időtartama öt perc) és a felülúszó fázisokat elkülönítjük. Az elkülönített felülúszó fázisokhoz 0,005 mólos acetát-puffért (pH 5,2 ml) adunk és a kapott oldatokat megelemezzük. Az elemzés úgy történik, hogy megmérjük, milyen mennyiségben választ ki az aliquot o-nitro-fenil-f-D-glükopiranozid oldatából o-nitrofenil-aniont. A kapott eredményeket az alábbi táblázatban adjuk meg. A poli-5-sav borát-komplexét az 1. példában ismertetett módon állíthatjuk elő, természetesen ezesetben 5-amino-szalicilsavat vagy poli-5-savat 40 használva. Minta Kiindulási enzimoldat (25 Ml aliquot A rekció utáni felülúszó fázis Szilárd anyag O. S. különbségek 420 nm-en 4A 4B 4C 5A 5B 5C 35 Vakminta 0.80 0.80 0.80 0.80 0.80 0.80 0.014 0.052 0.048 0.034 0.064 0.050 0.062 0.042 2.0 >2.0 2.0 >2.0 1.95 1.30 0.013 A fenti eredményekből látható, hogy a polimer minták a kiindulási oldatokból csaknem a teljes a-glükozidáz mennyiséget komplexbe vitték. 3. példa Szabad poli-4-sav és poli-5-sav, továbbá tán(III)-komplexeikés /3-glükozidáz reakciója 45 ti-Az alábbi mintákat 0-glükozidázzal komplexbe visszük. (A /3-glükozidáz szállítója a Koch-Light 50 Laboratories, aktivitása 1000 egység/mg.): A minta megjelölése 4A 45 C°-on szárított poli-4-sav-titán-komplex, 55 4B 4 C°-on szárított poli-4-sav-titán-komplex, 4C szabad poli-4-sav 5A 45 C°-ort szárított poli-5-sav-titán-komplex, 5B 4 C°-on megszárított poli-5-sav-titán-komplex, 5C szabad poli-5-sav. 60 Az egyes mintákat (20 mg) ötször (az egyes mosások időtartama 5 perc) desztillált vízzel mossuk. Ezután minden egyes mintához /3-glükozidáz (1 mg) desztillált vízzel (5 ml) készült 65 Az így előállított szilárd halmazállapotú enzimek aktivitása akkor sem csökken jelentősen, ha tízszeres mosást végzünk (az egyes mosások időtartama 5 perc) 0,005 mólos acetát-pufferrel, 0,1 mólos acetát-pufferrel vagy 0,5 mólos kalcium-klorid-oldattal. 1 mólos nátrium-klorid-oldatban oldott 1 mól szacharózzal végzett 5 perces, majd 0,005 mólos acetát-pufferrel végzett 5 perces mosás után azonban a szilárd halmazállapotú enzim aktivitása a mosás előtti aktivitásérték mintegy egyharmadára csökken. A példában használt polimer-titán-komplexeket következőképpen állítjuk elő. Az 1. példában ismertetett módon előállított poli-4-savat kétszer 5 n sósavval és kétszer desztillált vízzel mossuk, majd 12,5 vegyes%-os titán(III)-klorid-oldatban (10 ml) szuszpendáljuk és 15 percen át keverjük a kapott elegyet. Ezután az elegyet szűrjük az oxidálószerek elkülönítésére és így narancsszínű szilárd komplexet kapunk. A kapott polimer-titán-komplexet két részre osztjuk, az egyik részt egy éjszakán át 45 C°-on 6
