165648. lajstromszámú szabadalom • Eljárás O-hidroxi-benzoesav alapú homo polimerek és enzimek komplexeinek előállítására

13 165648 14 (4A minta), míg a másik részét egy éjszakán át exszikkátorban 4 C°-on tartjuk (4B minta). A megfelelő poli-5-sav-titán-komplexeket a fenti módon állítjuk elő, azonban természetesen fehér poli-4-sav helyett a 2. példában leírt módon előállított rózsaszínű poli-5-savat használunk. A szűrés után visszamaradó szilárd anyag sötétbarna színű. Az így előállított mintát két részre osztjuk és a fent ismertetett módon kezeljük. így kapjuk meg az 5A mintát (megfelel a 4A mintának) és az 5B mintát (megfelel a 4B mintának). 10 4. példa Poli-4-sav és poli-5-sav reakciója a-amilázzal titán(III)-komplexeinek 15 20 25 30 A 3. példában ismertetett módon előállított 4A, 4B, 5A és 5B mintákat (az egyes minták súlya 20 mg) ötször (az egyes mosások időtartama 2 perc) desztillált vízzel (5 ml) mossuk. Végső felülúszó úfázist elkülönítjük, majd ezután a Bacillus subtilius által előállított 1 mg a-amiláz (szállítója a Sigma Chemical Co. Ltd., Kingston-Upon-Thames, Surrey, Nagy-Britannia, aktivitása 500 és 1000 aktivitásegység/ mg között van) desztillált vízzel (5 ml) készült oldatát adjuk minden egyes mintához és az így kapott rekacióelegyeket 16 órán át 4C°-on keverjük. Ezután a felülúszó fázisokat elkülönítjük és a mintákat ötször desztillált vízzel (5 ml) és tízszer (az egyes mosások időtartama két perc) 0,1 mólos acetát-pufferrel (pH 5, 5 ml) mossuk. 35 Az így előállított szilárd halmazállapotú enzimeket ezután egyenként 0,005 mólos acetátpufferben (pH 5, 2 ml) szuszpendáljuk és addig keverjük, míg homogén szuszpenziókat nem kapunk. A szilárd halmazállapotú enzimek aliquot 40 részeit (a 4A és az 5A mintákból 1—1 millilitert, míg a 4B és az 5B mintákból 0,5-0,5 ml-t) vizsgálatnak vetjük alá az enzimaktivitás meghatározása céljából. A meghatározást a Bernfeld és társai által ismertetett módon (Samuelson és 45 Stramberg, Carbohydrate Research 3, 89, 1966) keményítőből maltózzá alakítás útján végezzük. A szilárd halmazállapotú enzimek aktivitását az alábbi táblázatban adjuk meg: 4A 2,56 aktivitásegység1

) /mg, 4B 2,27 aktivitásegység1

) /mg, 5A 1,51 aktivitásegység1

) /mg, 5B 4,44 aktivitásegység1

)/mg. 50 J) egy a-amiláz egységnek vesszük azt az a-amiláz mennyiséget, mely 1 //mól maltózzal egyenértékű redukáló cukrot szabadít fel 20 C°-on 1 perc alatt. A fenti eredmények alapján megállapítható, hogy a poli-4-sav és a poli-5-sav titán-komplexei az a-amilázt komplexbe viszik és az így kapott szilárd halmazállapotú enzimek jelentős enzimaktivitást mutatnak. 55 60 65 5. példa Poli-4-sav és poli-5-sav titán(III)komplexeinek reakciója glükamilázzal A 4. példában ismertetett kísérletet elvégezzük a-amiláz helyett 5 ml Agidex elnevezésű glükamilázkészítményt (közelítőleg 1 mg/ml hatóanyagtartalommal) használva. A szilárd halmazállapotú enzim 0,005 mólos acetátpufferrel (pH 4,5, 2 ml) alkotott homogén szuszpenziójának aliquot részeit (0,5 ml) megelemezzük a Bernfeld és társai által ismertetett módszerrel, azaz megmérjük, hogy keményítő oldatból a szilárd halmazállapotú enzim milyen mennyiségben választ ki glükózt. A szilárd halmazállapotú enzimek aktivitása az alábbi: 4A 0,304 aktivitásegység1

)/mg 4B 0,630 aktivitásegység1

)/mgl) 5A 0,323 aktivitásegység1

)mg 5B 0,450 aktivitásegység1

)/"« 1) egy glükamiláz egységnek nevezzük azt a glükamiláz mennyiséget, mely 1 /umól glükózzal egyenértékű redukáló cukrot szabadít fel 45 C°-on 1 perc alatt. A fenti eredményekből látható, hogy a poli-4-sav és a poli-5-sav titán-komplexei a glükamilázt komplexbe viszik és az így előállított szilárd halmazállapotú enzimek jelentős enzimaktivitást mutatnak. A szilárd halmazállapotú enzim aktivitásának a felhasználás függvényében jelentkező változását úgy határozzuk meg, hogy a fenti mintákat 0,1 mólos acetát-pufferrel (pH 5, 5 ml, 2 perc) mossuk, a felülúszó fázist elkülönítjük, a minta sűrűjét 0,005 mólos acetát-pufferben (pH 5, 1 ml) újra szuszpendáljuk és megismételjük az enzimaktivitás meghatározását. Az aktivitás csökkenése a kiindulási aktivitás %-ában az alábbi: Minta 1. felhasz2. felhasz3. felhasz4. felhasználás nálás nálás nálás 4A 100 58 54 47 4B 100 58 46 35 5A 100 60 61 57,5 5B 100 72,5 63,5 59,5 A fenti eredményekből látható, hogy a kezdeti, mintegy 30-40%-os csökkenés után a szilárd halmazállapotú enzimek enzimaktivitása hasznos és kielégítően állandó szinten marad az újrafelhasználás során. Ilyen szilárd halmazállapotú enzimek 10-20 órán át használhatók anélkül, hogy aktivitásuk gazdaságtalan szintre csökkenne. 6. példa A később ismertetett módon előállított N-akriloil-4-amino-szalicilsav homopolimer-titán(IV)-7