165580. lajstromszámú szabadalom • Eljárás poliriboinozinsav és poliribo- 2-tiocitidilsav származékok és e vegyületek fém és ammóniasóiból álló komplexeinek előállítására
9 165580 10 Az oltási védőhatás fokozódása közvetlenül is kimutatható, ha például egereket egy influenza virus oltóanyaggal beoltunk, az állatok felét A+B komplex-szel kezeljük és például 41 nappal a beoltás után az összes kísérleti állatot influenza 5 vírussal fertőzzük. A + B-vel kezelt kísérleti állatok nagyobb %-os arányban élik túl a fertőzést, mint a nem kezelt állatok. A + B komplex nemcsak fertőzéseknél, hanem tumoroknál is hatásos. Ez utóbbi hatás például 10 egereknél mutatható ki, amelyeket Ehrlich-féle asdtes-tumorsejtekkel beoltunk. Az A + B komplex-szel kezelt kísérleti állatok ezt a kísérletet hosszabb ideig túlélik mint a kezeletlenek. A+B illetve a komplex fém- vagy ammónium- 15 sóinak beadása parenterálisan vagy helyileg, főként egy . nyálkahártyára, mint az intranasális, conjunctivális vagy légzőútak nyálkahártyáira történhet. A hatásos dózis a fertőzés fajtájától és bizonyos mértékben a vírus fajtától is függ, ami 20 ellen védőhatást kívánunk létrehozni. Egereknél a duzzasztó dózis mintegy 0,5 mg/kg-ig, nyúlnál ez a dózis mintegy 0,05 Mg/kg. A következőkben részleteiben ismertetjük a találmány szerinti két-komponensű komplexek 25 előállítását és alkalmazását. A példákban polinukleotidokra megadott koncentrációértékek mindenkor a monomer nukleotidokra vonatkoznak, amelyekből a polimerek 30 felépülnek és amelyek mólsúlyaként a számított mólsúlyt (nukleozid-monofoszfát mínusz víz) feltételezzük. A végcsoportok figyelembe nem vételéből adódó hiba elhanyagolható mértékű. 35 A következőkben felsorolt sejttenyészet fenntartó közeg helyett természetesen más közegek is alkalmazhatók, mivel ezeknek a kétkomponensű komplexekre nincs hatásuk és csak a sejttenyészetek szempontjából jelentősek. 40 A következő példákban használt poliriboinozinsav ( = A) szokásos kereskedelmi áru, s2 owértéke 5,3. (Svedberg-konstans) A poliribo-2-tiocitidilsav- ( = B) amelyeket a következőkben 45 felhasználunk ismert módon állítható elő pl. a 2 041 435 számú Német-Szövetségi-Köztársaság-beli nyílvánosságrahozatali leírás szerint, ahol az 1/b. példa foglalkozik B komponens előállításával. E példa szerint 4 ml vizes elegyet (pH 8,3), amely 50 0,4 mmól trisz-(hidroximetü)-aminometán-hidrokloridot (=Tris.HCl), 0,008 mmól megnéziumkloridot, 0,04 mmól 2-tiocitidin-5'-difoszfát dinátriumsóját, 0,04 mmól ditio-treitolt és 10 enzimegység polinukleotid-foszforilázt specifikus 55 aktivitása 0,165 mmól UDP/óra* mg protein 37C°-on 4 óra hosszat 37C°-on inkubálunk. A protein leválasztása és a 1,5 ml-re bepárolt vizes fázis 3C°-on 0,01 smól Tris-HQ (pH = 7,0) szemben végzett 48 órás dialízise után olyan B 60 komponenst kapunk, amelynek s20 w -értéke 8,3 és a következő példákban kerül alkalmazásra. Megjegyezzük, hogy természetesen más s2 o w értékű A, illetve B komponensek is alkalmazhatók. «5 1. példa 0,53 ml 0,01 mólos trisz-(hidroximetil)-aminometán-Ha-pufferoldathoz (pH = 7), amely 0,19 Mmól/mmól B-komponenst tartalmaz 1,37 ml Hanksch-féle sóoldatot (v.o. pl. Hoskins, J.M. Virological Procedures, London, 1967, p313.) adunk, és ehhez hozzákeverünk 0,10 ml Hankschféle olyan sóoldatot, (pH = 7,0), amely 1 jumól/ml A-t tartalmaz. A 0,1 jumól A és B komponenst tartalmazó keveréket 1 óra hosszat szobahőmérsékleten állni hagyjuk, amikor A+B oldatához jutunk. A hiperkrómia a komponensek összegspektrumához képest 250 nm 18 % 260nm-nél 18,2% 270 nm 20,8% 280nm-nél 17 % Xmax = 247,5 nm, Xmin = 226 (M)34 o = -1,2 • 103 (M)32 o = 0, 01)303 = 1,4'103 , (M)2 »7=0, (M)262 =21,8-10 3 , (M) 242 =0, (M) 232 = 18,8 • 103 látszólagos pK= 11,5. 0 és 100 C° között A + B komplexnek nincs Tm értéke: 30%-os etilénglikol-tartalmú vízelegyben és 0,05 mól Na+ ion jelenlétében éles átmenet mutatható ki Tm = 77°-on. Az átlagos S2o w-érték A+B esetében 12,4 míg az s2 o w értékek integrált eloszlása A+B esetében a következő táblázatból tűnik ki, amelyet 0,1 mólos foszfátpufferben 7pH-értéken 20 000 fordulatszámnál 97 perc után mértünk. S20 w C'/C 5,5 0,02 6,5 0,04 7,5 0,08 8,5 0,13 9,7 0,20 10,5 0,28 11,5 0,39 12,5 0,50 13,5 0,83 14,5 0,93 15,5 1,00 A szabad poliribo-2-tiocitidilsawal szemben a kétkomponensű komplexben jelenlevő ilyen komponenst a polinukleotid-foszforiláz nem támadja meg. 2. példa 0,32 mg A komponenst 10 ml 0,001 mólos nátriumkakodilát oldatban (pH = 7) oldunk, amely 59 mg nátriumkloridot tartalmaz. Ehhez 1 ml 0,001 mólos B oldatot adunk és szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A komplex képződését spektrométeres úton követjük. Űy módon A + B komplex oldatához jutunk, amelynek tulajdonságai az 1. példa szerint nyert komplex-szel megegyeznek. 5
