165580. lajstromszámú szabadalom • Eljárás poliriboinozinsav és poliribo- 2-tiocitidilsav származékok és e vegyületek fém és ammóniasóiból álló komplexeinek előállítására
11 16558° 12 3. példa 5 ml 8,3 pH-értékű vizes keverékhez, amely 0,5 mmól trisz-(hidroximetil)-aminometán-Ha-puffert, 0,01 mmól magnéziumkloridot, 0,05 mmól 5 B komponenst és 0,16 mg dinátrium-2-tiocitidin-5'-difoszfátot tartalmaz, 5-enzimegység polinukleotid-foszforilázzal specifikus aktivitása 0,165 mmól UDP/óra« mg protein 37C°-on kezelünk és 4 óra hosszat , 37 C°-on tartjuk. A proteint 10 kloroform/izoamilalkohol elegyével többszörös extrahálással eltávolítjuk, a vizes fázist 15C°-on 2 ml-re bepároljuk és 48 óra hosszat 3 C°-on 0,01 mólos trisz-(hidroximetil)-aminometán-HQ-pufferrel szemben dializáljuk. Ily módon A+B komplex 15 olyan oldatához jutunk, amelynek tulajdonságai azonosak az 1. példa szerint előállított komplex megfelelő tulajdonságaival. 4. példa 4 ml 0,001 mólos nátriumkakodilát-oldathoz, amely 24 mg nátriumkloridot, 0,1 mmól poliribo-2,4-ditiouridilsavat és 0,1 mmól B komponenst 25 tartalmaz, hozzáadunk 3 térfogatrész 1 mólos nátriumszulfit-oldatból és 1 térfogatrész 1 mólos nátriumhidroszulfit-oldatból álló 20jul szulfit-reagenst. A reakciókeveréken levegőt szívatunk keresztül és 1 óra után még egyszer 20/d 30 szulfit-reagenst adunk hozzá. További 1 óra eltelte után a reakciót megszakítjuk, az elegyhez 0,5 ml 0,2 mólos ammóniumklorid oldatot adunk, vizes ammóniaoldattal 8,5 pH-értéket állítunk be, 1 óra hosszat az elegyet szobahőmérsékleten állni 35 hagyjuk, 2 ml-re bepároljuk és 60 óra hosszat 3 C°-on 0,01 mólos trisz-(hidroximetil)-aminometán-HCl-puffertel szemben dializáljuk. Ily módon A + B komplex oldatához jutunk, amelynek az 1. példa szerint kapott termékkel azonos tulajdonsa- 40 gai vannak. A. példa 45 1. példa szerint kapott A+B oldatból 18ml sejttenyészet fenntartó közeg hozzáadásával törzsoldatot készítünk. A sejttenyészet fenntartó közege kereskedelmi forgalomban kapható Tissue culture medium (TCM) 199-ből áll és adalék- 50 anyagként 1 ml törzsoldatban 0,168% nátriumhidrogénkarbonátot, valamint 100 IE penicillint és lOOjug sztreptomicint tartalmaz. A törzsoldatból a fentemlített fenntartó közeggel való hígítással 1-10 arányú sorozathígítást készítünk. 10-10 ml 55 hígított oldatot 7 napos primer nyúlvese sejtekből készült zárt sejtmassza fölé rétegzünk négyszögletes edényekben. Minden egyes hígítási fokhoz 3—3 edényt, ehhez 3 kontroli-edényt veszünk, amely A + B komplex nélkül kizárólag fenntartó 60 közeget tartalmaz. Az edényeket éjjelen át 35 C -on inkubálószekrényben tartjuk, majd szokásos módon herpes simplex vírussal fertőzzük. A minta fölé agart rétegzünk, még egyszer 48 óra hosszat 35 C°-on inkubáljuk, majd egy második *S színezéktartalmú agar-réteget adunk hozzá a sejtek megszínezésére. További 24 órás 35C°-on történő inkubálás után a makroszkopikusan látható vírus okozta plakkokat nagyító segítségével megszámoljuk. Minden egyes hígítási foknál 3 egyedi értékből átlagértéket számítunk, és ezt összehasonlítjuk a kontroll átlagértékével. Ezekből az értékekből grafikus úton a PRD50 értéket, vagyis 50% plakk redukció dózist -amely a plakk-számot 50%-kal csökkenti — meghatározzuk. Azonos A + B komplex oldattal végzett további kísérletekben 1:2 vagy 1:4 arányú sorozathígítást készítünk. Ezenkívül a további kísérletekben primer nyúlvese sejtek helyett szekunder sejteket alkalmazunk, egyik kísérletben pedig herpes simplex vírus helyett vaccinia vírust vizsgálunk. Sejtek Vírus PRD50 1 Primer nyúlvese Herpes simplex 0,0035 2 Primer nyúlvese Herpes simplex 0,0065 3 Szekunder nyúlvese Vaccinia 0,0030 4 Szekunder nyúlvese Herpes simplex 0,0061 A illetve B komponenst külön-külön is megvizsgáljuk, akkor 0,61 Mg/ml koncentrációig a fent megadott kísérleti feltételek mellett a plakk-szám csökkenése nem figyelhető meg. B. példa A 2. példa szerint előállított komplex biológiai aktivitásának mérésére plakk-redukciós próbát végzünk. A kísérleti elrendezés megfelel az A. példa szerintiének azzal a különbséggel, hogy kizárólag szekunder nyúlvese sejteket alkalmazunk. A sejttenyészet fenntartó közege a 3. és 4. példában sztreptomicint nem tartalmaz. Sejtek Vírus PRDS0 1 Szekunder nyúlvese Herpes simpl. 0,013 2 Szekunder nyúlvese Vaccinia 0,00067 3 Szekunder nyúlvese Herpes simpl. 0,0015 4 Szekunder nyúlvese Herpes simpl. 0,0057 5. példa Az 1. példa szerint A és B vegyületeket tartalmazó oldatokból kétkomponensű komplexet készítünk. Az A vegyület s20 w értéke 11,4; a B vegyület s20 w értéke: 13,8. A komplex s 20 w értéke 22,6. Xmix = 247,5 nm: Xm i„ = 226 nm. 6. példa Az 1. példa szerint A és B vegyületeket tartalmazó oldatokból kétkomponensű komplexet 6
