165465. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az AT-125 jelű antibiotikum előállítására

165485 11 12 1 Pridham, T. G., Hesseltine, W. C. és Benedict, R. G.: „A guide for the calassification of Streptomyoes according to selected groups. Placement of strains in morphological sections" Appl. Microbiol, 6, 52—79 (1958); 3 Dietz, A. és Mathews, J.:'„Classification of Streptomyces spore surfaces into five groups" Appl. Microbiol, 21, 527—-533 (1970). Az AT—125 előállítható, ha a mikroorganizmust vizes táptalajon merített aerob körülmények között tenyésztjük. Adott mennyiségű antibiotikum előállítására ismert módon használhatunk felületi kultúrákat, vagy a tenyésztést fermentorokban végezhetjük. A mikroorganizmus szénforrást és asszimilálható nitrogénvegyületet vagy fehérje jellegű anyagot tartalmazó táptalajon növekszik. Szénforrásként előnyösnek bizonyultak például a glükóz, nyerscukor, szacharóz, glicerin, keményítő, gabonakeményítő, laktóz, dextrin és a melasz. Nitrogénforrásként előnyösnek bizonyultak például a kukoricalekvár, élesztő, autolizált söripari keményítő tejextraktumokkal, szójababliszt, gyapotmagliszt, búzaliszt, tejből kapott szilárd anyagok, kazein hasnyálmirigyes kivonata, szeszipari szilárd melléktermékek, állatipepton-oldatok és csontliszt. Az említett szén- és nitrogénforrások kombinációi előnyösen használhatók. A fermentációs közeghez nem szükséges nyomelemek, így például cink, magnézium, mangán, kobalt és vas adagolása, minthogy a fermentációs közeg nem tisztított komponensei és a vízvezetéki víz kellő menynyiségben tartalmazzak az említett elemeket. Az AT—125 előállítása foganatosítható bármely, a mikroorganizmus növekedésének kedvező hőmérsékleten, például mintegy 18 °C és 40 °C, előnyösen mintegy 20 °C és 32 °C közötti hőmérsékleten. Általában a termék optimális hozama mintegy 2—10 nap alatt érhető el. A táptalaj a fermentálás során rendszerint enyhén savas — pH 5,5'—7,0 — marad. A végső pH-érték részben az adott esetben alkalmazott pufferektől, és részben a táptalaj kezdeti pH-értékétől függ, melyet a sterilizálást megelőzően előnyösen mintegy pH 7,0-ra állítunk be. Ha a tenyésztést nagyméretű fermentorokban végezzük, előnyös, ha a mikroorganizmus spórái helyett a mikroorganizmust vegetatív formában használjuk oltásra, hogy elkerüljük az i'ij antibiotikum előállítási sebességének, azaz a termelékenységnek a leromlását, illetve az ebből következő nem kielégítő berendezéskihasználást. Ennek megfelelően kívánatos, ha folyékony táptalajban vegetatív formájú oltóanyagot tenyésztünk a táptalajt ferde tenyészetből vagy termőtalajos tenyészetből vett aliquottal beoltva. Így fiatal, aktív vegetatív formában tenyésztünk, majd az oltóanyagot aszeptikus körülmények között betöltj ük a nagyméretű fermentorokba. A vegetatív formájú oltóanyag tenyésztésére szolgáló közeg azonos vagy eltérő lehet a fermentorba táplált táptalajtól. A döntő, hogy a mikroorganizmus gyorsan növekedjék. Az új antibiotikum, 3.Z3.Z SZ AT—125 amfoter vegyület. Oldható vízben, míg metanolban gyengén oldódik. Számos eljárás használható az AT—125 elkülönítésére és tisztítására, így például adszorpciós eljárások, melyeket megfelelő oldószerrel végzett eluálás követ, továbbá oszlopkromatográfia, 10 megoszlásos kromatográfia és oldószerekből végzett kristályosítás. Az AT—125 elkülönítése előnyösen végezhető például a fermentációs közeg közepesen porózus diatomaf öldön, például az FW 40 márkanevű di-15 atomaföldön (gyártó cég: Eagle Pieher) végzett szűrése útján. Más, e célra megfelelő diatomaföldek a Super Gel (gyártó cég: John Manville), a Dicalite 4200 (gyártó cég: Great Lakes) és a Miraflo 40 (gyártó cég: Eagle Pieher) márkanevű 20 termékek. A tiszta szűrletet sztirol típusú szulfonsavval töltött kromatográfiás oszlopon bocsátjuk keresztül. A hidrogénionokkal telített Dowex 50 márkanevű ioncserélő gyanta, különösen erősen 25 térhálósított gyanta, így a Dowex 50X16 bizonyult előnyösnek. Más megfelelő gyanták az Amberlite IR—120, Nalcite HCR, Chempro C— 20, Permutit Q és a Zeokarb 2,25 márkanevű termékek. Az oszlop megfelelő mosása után az an-30 tibiotikumot bázissal, előnyösen ammónium-4hidroxiddal eluáljuk. Az antibiotikumot tartalmazó eluátumokat összegyűjtjük és betöményítjük. Továbbá előnyösen a fenti módon kapott vizes 35 koncentrátumot úgy dolgozzuk fel, hogy semleges pH-értéken, azaz 6,2—7,8-on a vizes koncentrátumot sztirol típusú, enyhén bázikus políamin gyantával töltött oszlopon bocsátjuk keresztül E célra előnyösnek bizonyult a hidroxil-40 ^csoportokkal telített Amberlite IR márkanevű gyanta. Használható továbbá az Amberlite IR 4B, Nalcite WBR, DeAeidite E és Duolit A. 2 márkanevű gyanta is. Az oszlopot ionmentes vízzel, 50%-os vizes 45 metanollal, majd 90%-os vizes metanollal mossuk, és 0,1 n ecetsavval (GO%-os metanolban) eluáljuk. Az eluátum aktív frakcióit összegyűjtjük, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. Metanol helyett használhatunk vizet is. 50 A fenti módon kapott bepárlási maradékot ezután megoszlásos kromatográfiának vetjük alá úgy, hogy a bepárlási maradékot először n-butanolból, benzolból, metanolból és ionmentes vízből (2:1:1:1) álló oldószerrendszer alsó fázisá-55 ban feloldjuk. Az alsó fázist ezt követően homogenizáljuk valamilyen közepesen porózus diatomafölddel, például FW 40 márkanevű termékkel (gyártó cég: Eagle Piohers) és a fenti oldószerrendszer felső fázisával. A kapott homogenizált 60 elegyet ekkor olyan oszlop tetejére adagoljuk, amely közepes porozitású diatomaföldet tartalmaz, melyet előzetesen úgy állítunk elő, hogy a diatomaföldet a fenti oldószerrendszer felső fázisával feliszapoljuk, majd az oldószerrendszer 65 alsó fázisával alaposan átkeverjük, a kromatog-