165408. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-helyettesített 7béta-(D-5-amino-5-karboxi-vaIeramido)-7-metoxi-cef-3-em-4-karbonsav-származékok előállítására
165408 27 28 pott kultúrából a rázólombikba helyezett tápközeget beoltjuk, és a kultúrát rázatás közben inkubáljuk az említett hőmérsékleten. A termelő kultúrát ugyancsak hasonló módon tenyésztjük rázatott lombikban, állandó hőmérsékleten, néhány napig, majd az inkubációs időszak befejeztével a lombik tartalmát a micélium eltávolítása, céljából centrifugáljuk. A micéliumtól mentesített folyadékot azután betöményítjük, a 810A antibiotikumot a szokásos módon elkülönítjük és tisztítjuk. Nagyobb méretű termelés esetén előnyös, ha a fermentációt egy erre alkalmas, keverőberendezéssél és a közeg szellőztetésére alkalmas szervekkel felszerelt tartányban folytatjuk le. A tápközeget ebben a tartányban készítjük el, majd hőkezeléssel, kb. 120 °C-ig menő hőmérsékleten sterilizáljuk. Lehűtés után a steri^jzált tápközeget beoltjuk a termelő kultúrával és a fermentációt néhány, pl. 2—4 napig folytatjuk kb. 24—28 °C hőmérsékleten, a tápközeg keverése és/vagy szellőztetése közben. Az inokulumkultúra tenyésztési módjának, valamint a tápközeg megfelelő összetételének változtatásával a körülményekhez képest javíthatjuk a fermentáció hatásfokát és növelhetjük az antibiotikum termelését. A 810A antibiotikum mennyiségi meghatározása Proteus vulgaris segítségével: A 810A antibiotikum meghatározására célszerűen a korongmódszert alkalmazhatjuk, a Proteus vulgaris MB—838 törzset (ATCC 21100 és NRRL B-—3361) használva kísérleti mikroorganizmusként; ezt a törzset ferde agar tápközegben (Difco-agar), 0,2% élesztőkivonat hozzáadásával tenyésztjük. A beoltott lemezeket 37 °C hőmérsékleten 18—24 óra hosszat inkubáltatjuk, majd felhasználásig hűtőszekrényben tároljuk: az így előkészített kultúrákat egy héten belül fel kell használni. A meghatározás céljaira az inokulumot naponta készítjük el oly módon, hogy egy 250 mles Erlenmeyer-lombikban 50 ml Difco-tápközeget (húsfőzet + 0,2% élesztőkivonat) beoltunk az említett ferde agaros tenyészetről lekapart inokulummal. A lombikot azután 34 °G hőmérsékleten, rázógépen 18—,24 óra hosszat inkubáltatjuk. Ezt a kultúrát azután 0,2%-os élesztőkivonat-oldat hozzáadásával oly mértékben hígítjuk, hogy a közeg áteresztése 660 millimikron hullámhosszon 40% legyen (Bausch & Lomb „Spectronic 20" műszerrel mérve). Vakpróbaként beoltatlan tápközeget alkalmazunk. A fenti módon beoltott, inkubáltatott és beállított kultúrát azután 1 liter tápközeg beoltására használjuk fel. Ez utóbbi tápközegként Difeo-agar tápközeget alkalmazunk, 0,2% élesztőkivonat hozzáadásával. A tápközeget autoklávban sterilizáljuk és 50 °C hőmérsékletre lehűlni hagyjuk. A tápközeg beoltása után 10—10 ml adagokat adunk steril Petri-csészókbe és ott a közeget kihűlni hagyjuk. A Petri-csészékben kihűlt és megszilárdult agarlemezekre helyezzük azután az lr 2 cm átmérőjű szűrőpapír korongokat, a vizsgálandó aktivitású oldattal átitatva. A ráhelyezett korongokkal az agarlemezeket 37 "C hőmérsékleten 20'—24 óra hosszat inkubáltatjuk. A vizsgálat 5 eredményét az ezután tapasztalt gátlási zóna mm-ben kifejezett átmérője alapján értékeljük. A kapott értékeket vagy viszonylagos aktivitásértékekként vesszük figyelembe, vagy pedig egy tisztított standardmintához viszonyítjuk és így 10 mcg/ml értékekben adjuk meg. Ha ezt a vizsgálatot mennyiségi meghatározásra alkalmas módon folytatjuk le, azt tapasztaljuk, hogy a fent leírt módon kapott termelőfermentáció közegben az antibiotikum-tartalom 2—4 mcg/ml. 15 A 810A antibiotikum meghatározása Vibrio percolans mikroorganizmus alkalmazásával: A fent leírt korongmódszerrel Vibrio percolans mikroorganizmus (MB—1272 törzs) alkalmazásával is mértük a fermentációs termékben 20 jelenlevő 810A antibiotikum mennyiségét. Ez esetben is 1,2 cm átmérőjű szűrőpapír korongokat használtunk. A vizsgálat céljaira szolgáló agarlemezes kultúrákat Difco-tápkÖzeggel, 2,0 g/liter Difco-élesztőkivonat hozzáadásával készí-25 tettük el a fent leírt módon, 10—10 ml beoltott tápközeget alkalmazva lemezenként. A vizsgálat céljaira alkalmazott Vibrio percolans kultúrát (MB—127,2 törzs) a fentebb említett tápközegben, 0,2% élesztőkivonat hozzáadásával éjjelen 30 át inkubáltattuk, majd steril sóoldattal annyira hígítottuk a kapott mikroorganizmus-szuszpenziót, hogy annak 660 millimikron hullámhosszon mért áteresztése 40% legyen. Ezt a szuszpenziót literenként 20 ml mennyiségben adtuk a fent 35 említett tápközegben a lemezeknek a Petri-csészékben történő elkészítése előtt. A fenti módon elkészített lemezeket felhasználásik 4 °C hőmérsékleten tartottuk (legfeljebb 5 napig). A vizsgálat lefolytatása során az 4" antibiotikum oldatával telített korongokat ráhelyeztük a lemezekre, és ezeket 28 °C hőmérsékleten 8—24 óra hosszat inkubáltattuk. A gátlási zónákat mmnben mértük. 45 Baktériumok inaktiválása 810A antibiotikummal Egy további, in vitro lefolytatott kísérletben 50 vizsgáltuk a S10A antibiotikum rezisztenciáját a baktériumináktiválással szemben, a C-cefalosporin-, cefaloridin és cefalotin antibiotikumokkal összehasonlítva. A vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy a 810A antibiotikum stabilabb a vizsgálatok során alkalmazott egyes mikroorganizmusokkal szemben, mint az említett ismert antibiotikumok. Az antibiotikumok lebontására e vizsgálatok 60 során egy oly mikroorganizmust alkalmaztunk, amelyről ismeretes, hogy a C-cefalosporint teljesen inaktiválja; ez az Alcaligenes faecalis MB —9 törzs volt. É vizsgálatokat az alább leirt módon végez-65 tük:
