165408. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-helyettesített 7béta-(D-5-amino-5-karboxi-vaIeramido)-7-metoxi-cef-3-em-4-karbonsav-származékok előállítására

165408 29 30 a) A baktériumsejtek elkészítése: az Alcaligenes faecalis MB—9 törzs tenyészetéből vett mintát néhány ml oly tápközeggel kevertük, amely 0,2% élesztŐkivonatot tartalmazott. A kapott szuszpenzió egy oltókacsnyi mennyiségét szétkentük egy ferde agar felületen és 18 óra hosszat inkubáltattuk 37 °C hőmérsékleten. Az így elkészített mintákat 5°C hőmérsékleten tároltuk, és egy héten belül felhasználtuk őket. Ennek során a ferde agar felületen tenyésztett kultúra oltókacsnyi mennyiségét aszeptikus úton átvittük 50 ml 0,2% élesztŐkivonatot tartalmazó tápközegre, és rázás közben 18 óra hosszat inkubáltattuk 28 °C hőmérsékleten. A kultúrát azután 10 percig centrifugáltuk, percenként 4000 fordulattal. A szupernatáns folyadékot dekantáltük, és a visszamaradt sejtüledéket steril 1,0 mólos foszfát-pufferoidattal (pH •= 7,5; összetétel: 6,8 g káliumfoszfát és 7,1 g nátriumhidrogénfoszfát 1 liter desztillált vízben) kétszer mostuk. Az így mosott sejteket azután egy oly oldatban szuszpendáltuk, amely 4 mg/ml antibiotikumot tartalmazott 0,1 mólos foszfát-pufferoldatban; erre a célra ez utóbbi oldatnak oly menynyiségét alkalmaztuk, amely az eredeti oldat térfogata 1/10 részének felelt meg. Ezt az elegyet azután rázás nélkül, vízfürdőn 37 °C hőmérsékleten 4 óra hosszat inkubáltattuk; majd 10 percig centrifugáltuk percenként 2000 fordulattal. A kapott tiszta szupernatáns folyadékot steril kémcsövekbe dekantáltuk, majd szárazjéggel azonnal megfagyasztottuk a kémcső tartalmát, és a biológiai meghatározás lefolytatásáig (ami általában 3 órán belül megtörténik) ilyen fagyasztott állapotban tartottuk. Kontrollmintákat pontosan ugyanilyen módon kezeltünk, csupán baktériumsejteket nem adtunk ezekhez. b) A S10A antibiotikum inaktiválódásának mérése: A fent leírt centrifugálási művelet során kapott szupernatáns folyadékkal megnedvesített, 0,6 cm átmérőjű szűrőpapír korongokat ráhelyeztük a fentebb már leírt módon, 0,2% élesztőkivonat-tartahnú tápközeggel elkészített agarlemezek felületére: ezek az agarlemezek előzőleg be lettek oltva a vizsgálati mikroorganizmusokkal. A Bacillus subtilis MB—964 törzzsel, mint kísérleti mikroorganizmussal végzett vizsgálatokhoz a beoltott agarlemezeket a következő módon készítettük el: a mikroorganizmus mosott spóráinak 0,9%-os sóoldattal készített szuszpenziójából 5—5 ml mennyiséget adtunk a 0,2% élesztŐkivonatot tartalmazó agaros tápközeg 150 —150 ml-es adagjaihoz, majd az így beoltott közegből 5 ml-es adagokat vittünk be egy-egy 15X100 mm méretű Petri-csészébe. Az így elkészített lemezeket 5 °C hőmérsékleten tároltuk és elkészítésük után 3 napon belül felhasználtuk őket. A korongok ráhelyezése után a lemezeket éjjelen át inkubáltattuk 25 °C hőmérsékleten, majd ezután mértük a korongok körül kialakult gátlási zóna átmérőjét. A vizsgált antibiotikumok sejtmentes közeggel készített kontrollmintáit 1:1, 1:2. 1:4. 1:8, 1:16 és 1:32 arányú hígításokban vizsgáltuk, a standard vonatkoztatási görbe felvétele céljából. A vizsgált antibiotikumok oldatait hígítás nélkül vizsgáltuk, a mosott baktériumsejtekkel beoltott lemezeken, a fent leírt módon történő inkubáltatás után. Valamennyi vizsgálatot 3—3 5 párhuzamos kísérletben végeztük. c) Eredmények: Az inaktiválódási százalékarányt az említett három párhuzamos kísérletben kapott gátlási zónaátmérők átlagértéke alapján számítottuk ki; meghatároztuk a vizs-10 gált oldatban visszamaradt antibiotikum-menynyiséget, a standardgörbe alapján. Ezt az értéket levontuk a kiinduló antibiotikum-koncentrációból (4 mg/mm), és a maradékot a kiinduló koncentrációval osztottuk és 100-zal szoroztuk, 15 az inakíiválási százalék kiszámítása céljából. A C-cefalosporin, cefalotin és 810A antibiotikum esetében így kapott inaktiválási %-értékeket a következő táblázatokban adjuk meg: 20 35 35 40 Inaktiválási százalék, Alcaligenes faecalis MB—9 törzzsel való 3 órai inkubálás után, B subtilis MB—964 lemezeken mérve Antibiotikum Inaktiválási % 810A 3" C-cefalosporin cefalotin 0 99+ 62.5 Inaktiválást százalék, Alcaligenes faecalis MB—9 törzzsel való 3 órai inkubálás után, V. percolans MB—1272 lemezeken mérve. Antibiotikum 45 810A C-cefalosporin cefalotin Inaktiválási % 0 99+ 50 Meghatároztuk a 81OA antibiotikum és a C-cefalosporin ellenállóképességét az Aerobacter 3<> cloacae MB—2646 törzs kultúrájának lebontó hatásával szemben is. Ezt a kultúrát Gram-negatív jellegűnek és a C-cefalosporinnal szemben rezisztensnek ismerjük. A vizsgálat lefolytatása során a vizsgált 55 antibiotikum oldatának és a mikroorganizmus sejtmentes kivonatának elegyét 2 óra hosszat inkubáltatjuk és ezután határoztuk meg a megmaradó antibiotikum-akti vitását. A vizsgálat módszere ugyanolyan volt, amint azt fentebb az 69 Alcaligenes faecalis esetében leírtuk. Az inaktiváló mikroorganizmus-készítményt oly módon készítettük el, hogy az Aerobacter cloacae MB— 2646 törzs 37 °C hőmérsékleten történő 18 órai rázatással inkubált kultúrájának a szűrletét 65 1:160 arányban hígítottuk. A kultúra 0,2%