165268. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(alfa-amino-alfa-fenil- acetilamino)- 3-metil-CEF-3-ÉM-4-karbonsav előállítására
5 165268 6 bepároljuk vagy liofilizáljuk, vagy a vizes sóoldatot • egy bázis hozzáadásával beállítjuk 4,5 pH-ra, és a cefalexint szabad állapotban elkülönítjük. Azt is megtehetjük, hogy a reakcióoldatot ioncserélő gyantán átbocsátjuk, majd a gyantát vizes savval, például vizes ecetsavval eluálva a cefalexint elválasztjuk a reagálatlan I és II általános képletű kiindulási anyagoktól. A cefalexint tartalmazó frakciókat bepároljuk, vízben oldjuk, és az oldat pH-ját 4,5-re beállítva a cefalexint szabad állapotban kicsapjuk. A szabad cefalexin átalakítható nem toxikus, például alkálifém sójává ismert műveletekkel. A cefalexin hatóképessége vagy titere mikrobiológiailag állapítható meg papírkorongos módszerrel 37 C8 -on 16 óra alatt vizsgálati mikroorganizmusként Bacillus subtilis PCI-219 törzset használva. A következő példák szemléltetik a találmány gyakorlati végrehajtását anélkül, hogy azt az ismertetett műveletekre kívánnánk korlátozni. 1. példa a) Az enzim előállítása: 1% polipeptont, 1% húskivonatot és 0,5% nátriumkloridot tartalmazó 7 pH-ju vizes táptalajból 20 litert betoltunk egy 30 literes fermentorba, 20 percig 120 C8 -on sterilizáljuk, beoltjuk 200 ml Bacillus megaterium B—400 FERM-P 748 oltóanyaggal, amelyet előzőleg ugyanilyen összetételű táptalajon 30 C*-on 24 óra alatt készítettünk, majd percenként 20 liter levegővel való levegőztetéssel, percenként 300 fordulattal való keveréssel 48 óra hosszat 30 C°-on fermentálunk. Ezután a mikroorganizmust kicentrifugáljuk, és így 17,4 liter fermentlészüredéket kapunk. Ezt a szüredéket 30-35 C°-on 1/3 részére bepároljuk, és 80%-ban telített ammóniumszulfát oldatot adunk hozzá. A keletkezett csapadékot elválasztjuk, desztillált vízben oldjuk, majd sephadex G-25 oszlopon átbocsátva az oldatot sótalanítjuk. Az így kapott sótalan enzim oldatot liofilizálva 24,3 g terméket kapunk. b) A cefalexin előállítása: 20 mg 3-metil-7- fenoxiacetamido- 3-cefém- 4-karbonsavas nátriumot és 80 mg d-fenilglicin- etilészterhidrokloridot feloldunk 10 ml 0,1 mólos foszfátpuffer oldatban (7,5 pH). Ezt az oldatot hozzáadjuk 100 mg fent leírt módon készült enzimkészítményhez, és 37 C*-on 5 óra hosszat inkubáljuk. A reakciófolyadékot egy cellulózszármazékból álló vékonyréteg-kromatográfiai lemezre felhordva és 3:1:1 arányú n-butanol-ecetsav-víz oldószerrendszerrel kifejlesztve Rf-értékként 0,65—öt kapunk a cefalexin foltjára. A reakciófolyadékot n sósavval beállítjuk 2 pH-ra, etilacetáttal extraháljuk a reagálatlan 3-metil-7-fenoxi- acetamid-3- cefém- 4-karbonsavas nátrium eltávolítására, és így cefalexint kapunk 9,1% kitermeléssel. 2. példa a) Az enzim előállítása: 20 liter 0,5% glukózt, 0,3% glicerint, 1,0% húskivonatot és 1,0% polipeptont tartalmazó 7,0 pH-ju vizes táptalajt betoltunk egy 30 Uteres fermentorba, 20 percig 120 C*-on sterilizáljuk, beoltjuk 200 ml Bacillus megaterium B-400 FERM-P 748 oltóanyaggal, amelyet előzőleg ugyanolyan táptalajban 24 óra alatt 30 C6-on készítettünk, majd percenként 20 liter levegővel való levegőztetéssel percenként 300 fordulattal keverve 72 óra hosszat 30 C°-on fermentáljuk. A 5 fermentálás után a mikroorganizmust centrifugálással eltávolítjuk. A szüredéket 30-35 Ce -on térfogata 1/3 részére koncentráljuk, és hozzáadunk 60 tf% acetont. A csapadékot szűréssel elválasztva és megszárítva 25,5 g enzimkészítményt kapunk. 10 b) A cefalexin előállítása: 0,01 mól (3,45 g) 3-metil-7-fenilacetamido-3-cefém- 4-karbonsavás nátriumot és 10 g D—fenilglicin-etilésztert-hidrokloridot feloldunk 1 liter 0,1 mólos foszfát-puffer oldatban (7,5 pH). Ehhez az 15 oldathoz hozzáadunk 10 g fent leírt módon készült enzimkészítményt, és 5 óra hosszat 37 C*-on inkubáljuk. Ezután a reakciókeveréket átbocsátjuk egy ultramikroszürőn, és csökkentett nyomáson felére koncentráljuk. A koncentrátum pH-ját jéggel való hűtés 20 közben trifluorecetsav hozzáadásával beállítjuk 2,5 értékre, etilacetáttal mossuk a reagálatlan 3-metil-7-fenil- acetamido- 3-cefém-4-karbonsavas nátrium eltávolítására, majd vákuumban térfogata 1/4-re koncentráljuk. A koncentrált oldat pH-ját trifluorecetsawai 25 beállítjuk 1 értékre, majd ismételten metilizobutilketonnal extraháljuk. A szerves oldószeres réteget elválasztjuk, és szárítás után bepároljuk. A maradékhoz etilétert adunk, mire a cefalexin-trifluoracetát rózsaszín porként kicsapódik. Ezt a sót 5 ml vízben 30 oldjuk, és az oldat pH-ját jéggel való hűtés közben trietilaminnal beállítjuk 4,5 értékre. A szuszpenzióhoz 10 ml acetont adunk, a csapadékot szűrőre visszük, és jéghideg 80%-os vizes acetonnal mossuk. Szárítás után 33,2 mg fehér porszerű cefalexint 35 kapunk. Hozam 9,6%. [a]£° = + 149 (c=l, vízben). Ultraibolya spektrum: abszorpció 261 és 237 mju. 3. példa i 40 100 ml 0,5% glukózt, 0,3% glicerint, 1% húskivonatot, 1% polipeptont és 0,5% nátriumkloridot tartalmazó 7,0 pH-ju vizes táptalajt betoltunk egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba, 20 percig 120 C°-on 45 sterilizáljuk, beoltjuk Bacillus megaterium B—400 FERM-P 748 törzzsel, és 48 óra hosszat 30 C°-on tenyésztjük. A fermentálás után a szüredék pH-ját n nátriumhidroxid oldattal beállítjuk 7,5 értékre, 50 mg 3-metil-7-fenilacetamido-3- cefém-4- karbonsavas nát-50 riumot és 100 mg D-fenilglicin-etilészter- hidrokloridot adunk hozzá, majd 37 C°-on 5 óra hosszat inkubáljuk. A reakciókeveréket cellulózos vékonyréteges kromatografálással ellenőrizzük, a kifejlesztést 3:1:1 arányú n-butanol-ecetsav-víz eleggyel végezve, és 55 a cefalexinnek megfelelő foltot Rf 0,66 értéknél találjuk. A reakciókeveréket n sósavval beállítjuk 2 pH-ra, és etilacetáttal mosva eltávolítjuk belőle a reagálatlan 3-metil-7-fenilacetamido- 3-cefém- 4- karbonsavas nátriumot. A kitermelés cefalexinből 19,4%. 4. példa A 3. példában leírt módon eljárva, de a D 65 fenilglicin-etilészter-hidrokloridot D-fenilglicin- metilészterrel helyettesítve 13,4% kitermeléssel kapjuk a cefalexint. ' 3
