165268. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(alfa-amino-alfa-fenil- acetilamino)- 3-metil-CEF-3-ÉM-4-karbonsav előállítására

3 165268 4 kál. £&&c<uya táptalajon vízben oldható pigmentet képez. Zselatint nem folyósít el. Mannózból savat képez. Szénhidrogének fermentálhatósága: pozitívak: glukóz, mannóz, fruktóz, ribóz, maltóz, trehalóz, cellobióz, mannit, glicerin, keményítő; negatívak: arabinóz, xüóz, galaktóz, ramnóz, szacharóz, laktóz, raffinóz, szorbit, inozit, glucit, inulin, szalicin. Az American Type Culture Collection megállapítása szerint a Bacillus megaterium B—400 törzs a Bacillus megaterium var. penicillalytioumtól (ATCC 14945) a következőkben különbözik: a zselatint nem folyósítja el, lakmuszteiben a pigmentet redukálja, burgonyaagaron vízben oldható barna pigmentet termel, es mannózból savat képez. Az új törzs az „Institute for Microbiological Industry and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japán törzsgyüjteményében FERM-P 748 számon van deponálva és hozzáférhető. A találmány szerinti eljárásban használt enzim kinyerésére a mikroorganizmus tenyésztési útján kapott és megszűrt fermentlevet átbocsátjuk egy kovafölddel töltött oszlopon, ahol az enzim a kovaföldön adszorbeálódik. Ezután az enzimet 0,1 mól trisz-HCl-pufferos 25%-os vizes ammóniumszulfátoldattal (8,5 pH) eluáljuk/trisz = 2-amino-2-hidroximetil- 1,3-propándiol), az eluátumot 0,1 mólos 7,0 pH-s foszfátpufferral szemben dializáljuk. Dializálás után az enzimoldatot vákuumban 30 C°-on bepároljuk, és a koncentrátumot karboximetilcellulózzal töltött, 0,025 mólos foszfátpufferból (6,5 pH) adszorbeáltatjuk. Az oszlopot ugyanazzal a pufferral mossuk, majd az enzimet 0,1 mólos foszfátpufferral (6,5 pH) eluáljuk. Az enzim optimális pH-ia 7,0. Stabilitása 4 C°-on 5-10 pH-nál 24 óra, 37 C-on 6-10 pH-nál 24 óra. Hőállósága: 40 C alatt 7,5 pH-nál 2 nap; 50 C°-on 30 perc alatt aktivitása 50%-át, 60 C-on 30 perc alatt aktivitása 100%át elveszti. Az enzim fajlagos aktivitása: Vegyület A az I képletben) aktivitás, % fenilacetil-csoport 100 valerilcsoport 26,35 butirilcsoport 20,47 fenoxiacetil-csoport 16,00 A találmánynak az a lényege, hogy ilymódon sücerül az értékes antibiotikus hatású cefalexint enzimes átacilezéssel, 7-acilamino-dezacetoxicefalosporánsavból az utóbbi elkülönítése és tisztítása nélkül előállítani. Az I általános képletű cefaloszporin-származék fermentáció útján előállított penicillinből, például penicillin G—bői vagy penicillin V—bői állítható elő gyűrűbővítéssel, például olymódon, hogy penicillinészter oxidját iners szerve*- -1 !

. serben p-toluolszulfonáttal forraljuk vagy iners ->.. > •& oldószerben egy halogénalkánfoszfáttal vagy ü-szubsztituált ortofoszfáttal reagáltatjuk. Az I általános képletű vegyület az enzim hatását nem gátló kationnal alkotott sója alakjában használható.Az ilyen só rendszerint vízben oldható nátriumvagy káliumsó. A II általános képletű fenilglicinszármazékot vagy annak sóját a 7-acilamino--dezacetoxicefaloszporánsav 7-helyzetben lévő aminocsoportjával reagáltatva a-aminofenilacetamido-csoport keletkezik. Ebben az esetben a fenilglicin karboxilcsoportja általában egy reaktív csoporttal lehet szubsztituáltva. Előnyösen 5 fenilglicinanúdot, fenilglicilgUcint, fenilglicin- metilésztert, fenilglicin-etilésztert vagy hasonló származékokat használunk. E vegyületek közül a vízben oldhatatlanok vagy rosszul oldódok az enzimhatást le nem rontó vízben 10 oldható sóik alakjában alkalmazhatók. A II általános képletű vegyületek vagy sóik racém vagy optikailag aktív alakban lehetnek. A Bacillus megaterium B-400 FERM-P 748 törzs tenyésztése során keletkező fermentléből vagy annak 15 szüredékéből elkülöníthető a 7-acilamino-dezacetoxicefalosporánsav- 7-helyzetben lévő aminocsoportjára ható dezaciláz (aciláz). A fermentlé felhasználható közvetlenül vagy koncentrálás után. Az enzimkészítményhez ismert elkülönítő és finomító műveletekkel 20 juthatunk. Például a nyers enzim előállítására egy vízben oldható só, például ammóniumszulfát vagy nátriumklorid telített vagy csaknem telített oldatát hozzáadjuk az eredeti vagy koncentrált fermentléhez. Ugy is eljárhatunk, hogy a nyers enzimet vizzel 25 elegyíthető szerves oldószernek, például metanolnak, etanolnak vagy acetonnak a fermentléhez adásával kicsapjuk. Kis molekulasúlyú szennyezések a nyers enzim vizes oldatából féligáteresztő hártyával való dializálással távolíthatók el. Színező anyagok, kis 30 molekulasúlyú proteinek és hasonló szennyezések a fermentlé szüredékéből adszorpciós kromatografálással, ioncserélő kromatografálással vagy gélszűréssel választhatók ki. Az ezekkel a finomító műveletekkel kapott enzimoldat vákuumban bepárolva vagy liofili-35 zálva porított enzimkészítményt szolgáltat, vagy közvetlenül felhasználható az enzimes reakcióhoz. A találmány értelmében az I és II általános képletű vegyületeket a 7-acilamino-dezacetoxicefaloszporánsav 7-helyzetére ható, Bacillus megaterium B—400 40 FERM-P 748 által termelt dezacilázzal (acilázzal) kezelve cefalexint állítunk elő. Az enzinuműködésére optimális pH 7-8, ennélfogva az átacilezési reakciót előnyösen 7—8 pH-nál végezzük. Ezért a reakcióközeget 7—8 pH értéken 45 tartjuk, vagy előnyösen a reakciót egy 7—8 pH—ju puffer oldatban végezzük. A reakcióhőmérséklet 30 és 45 Cs

között lehet, előnyösen 35-40 C°. A reakcióidő a körülmények szerint 1—10 óra. Amikor a reakciókeverékben a cefalexin koncentrációja a 50 legnagyobb, a reakciót befejezettnek tekintjük. A termelt cefalexin a reakciófolyadékból a cefalexin elkülönítésére használt ismert művelettel nyerhető ki. Például a reakciófolyadékot ultraszürjük 55 a nagymolekuláju fehérjék és enzimek eltávolítására, a pH-ját savval beállítjuk 2-3 értékre, majd a folyadékot etilacetáttal, butilacetáttal, metilizobutilketonnal vagy más vizzel nem elegyíthető oldószerrel mossuk a reagálatlan I általános képletű vegyület 60 eltávolítására. Ezután a vizes réteg pH-ját savval beállítjuk 1 értékre, majd vizzel nem elegyedő szerves oldószerrel, példáulmetilizobutilketonnal extraháljuk, és a szerves réteget szárítjuk, majd bepároljuk a cefalexinnek só alakjában való kicsapására. Ugy is 65 eljárhatunk, hogy a sót vízben oldjuk, az oldatot vizzel nem elegyedő szerves oldószer jelenlétében egy anioncserélő gyantával kezeljük, majd a vizes oldatot